Western Blotting实验流程

第一步：蛋白样品制备

        蛋白抽提质量的好坏直接决定着Western结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。作为沃尔森的优势产品，我们为您提供RIPA改良型试剂盒以提取细胞或组织的总蛋白。

        RIPA改良型试剂盒（WB0001，WB0002）中提供蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、裂解缓冲液Lysis Buffer、PMSF等，可在非变性条件下从哺乳动物组织和培养细胞中提取总蛋白，获得的总蛋白可用于Western Blotting、免疫共沉淀等后续研究。

 

第二步：蛋白定量

        为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定蛋白浓度。蛋白浓度的测定方法，应根据组织细胞裂解或匀浆所使用的方法及裂解液的不同选用，因为去垢剂和还原剂等对不同蛋白浓度测定方法的影响差别很大。如使用沃尔森公司生产的RIPA改良型试剂盒，建议您使用BCA法测定蛋白浓度（WB0003，WB0004）。

 

第三步：电泳

(1) SDS-PAGE凝胶配制

        沃尔森的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（WB0006）提供了所需的试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方，我们也为您提供了制胶所需的各种组分：30% Acr-Bis(29:1)（WB0014）； 40% Acr-Bis(39:1)（WB0015）； PMSF(100mM)（WB0016） ；0.5M Tris-HCl,pH6.8（WB0017）； 1.5M Tris-HCl,pH8.8（W0018）。 

(2) 样品处理

        每80μL样品加入20μL的5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（WB0005），混匀。置于100℃的水浴加热10min，14000g离心20min，取上清液进行电泳。

(3) 上样与电泳

 

第四步：转膜

        转膜缓冲液可以参考《分子克隆》自行配制。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

        转膜效果可以通过预染蛋白质分子量标准观察转膜效果，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。也可以用沃尔森的丽春红染色液（WB0008，WB0009）对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，并用铅笔在膜上做出适当标记。还可以用沃尔森的蛋白质考马斯亮蓝染色检测试剂盒（WB0010）对转膜后的PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

 

第五步：封闭

        丽春红染色后可用铅笔在膜上做出适当标记，然后用预先准备好的WB洗涤液（WB0011）漂洗3～5min，将膜上的红色洗去。（注意：以后所有的步骤均要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。）弃去洗液后，加入10%的脱脂奶粉（建议使用：完达山脱脂奶粉；奶粉可用WB洗涤液溶解），在摇床上缓慢摇动,室温封闭60min。如背景较高，可以在4℃ 封闭过夜。

 

第六步：孵育

1．一抗孵育

        参考一抗的说明书，按比例稀释一抗。在室温下孵育2小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。

2．二抗孵育

        参考二抗的说明书，按比例稀释二抗。在室温下孵育1小时，然后用WB洗涤液（WB0011）漂洗膜，每次10min，共3次。

 

第七步：显色

        建议选用Pierce公司生产的ECL发光液。

 

第八步：显影

        ECL发光液处理过的膜，用保鲜袋包裹后，与X光片一起置于暗合中。根据荧光的强弱进行适当时间的曝光，取出X光片置于显影液，定影液中显影（WB0012）。

 

western流程

1. 制样

2. 制胶

根据蛋白分子量配置合适的分离胶

↓

灌胶后立即用蒸馏水封胶，分离胶大凝固后，胶与水之间可见明显的分界线

↓

胶凝后将水倒出，并用滤纸将剩余水吸干，注意不要伤害胶面；

↓

根据蛋白分子量配置合适的浓缩胶，小心将梳子完全插入胶内

↓

浓缩胶凝固后，从胶板中将梳子小心且垂直取出。

↓

在两个玻璃板之间的内槽加入已经降温至4℃的新鲜配制的电泳缓冲液；外槽可加入回收的缓冲液

↓

样品上样

 

3. 电泳

通常情况下，电泳槽盖子上的红色代表正极、黑色代表负极。电泳槽内支架探头上的红色代表正极、白色代表负极。将盖子加在电泳槽上时，应红色对红色、黑色对白色。

↓

直至溴酚蓝至胶的底线附近

 

4. 转膜

将转移缓冲液倒入白瓷盘中，将转膜用的夹子、NC膜和4层滤纸置于其中，并将2层滤纸置于黑色片夹（负极）的内侧

↓

关闭电泳的电源，取出胶板，回收缓冲液

↓

将浓缩胶、多余的分离胶切除，剩余的分离胶置于滤纸上，再在其上加NC膜，最后再放2层浸湿的滤纸

↓

将装好的片夹以及小冰盒置于转移槽内，将瓷盘中的缓冲液也倒入转移槽内

↓

接通电源，一定要注意正负极：黑色为负极；红色为正极

 

5. 与一抗、二抗反应：

将丽春红染料置于塑料盒中

↓

取出NC膜，用丽春红染色，直至marker可以看见为止，大约1~2min左右。必须要用铅笔将marker标出，并标记好各泳道的位置

↓

将NC膜置于含有10% 牛奶Blocking buffer的塑料盒中，封闭非特异性抗原。将塑料盒置于摇床上，20转/min，室温1h（或4℃过夜）

↓

TTBS稀释一抗，将稀释好的一抗与NC膜共同孵育，2h，室温（或4℃过夜）

↓

用TTBS洗NC膜，置于摇床上，30转/min，室温，10min/次×3次

↓

用TTBS稀释二抗。将稀释好的二抗与NC膜共同孵育，1h，室温（或4℃过夜）

↓

用TTBS洗NC膜，置于摇床上，30转/min，室温，10min/次×3次

 

6. ECL显色：

参照ECL试剂盒的使用说明书进行操作

↓

将曝光的X光片在显影液中显影

↓

自来水中漂洗

↓

X光片在定影液中定影

↓

流水冲洗

↓

晾干