双光子显微镜活体成像定量测量血液动力学 

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[摘要]利用双光子显微镜测量动物血液动力学最早的文献大概是起源于1998年, 由David Kleinfeld等人在PNAS上发表的, 采用类似的方法的文章越来越多,在国内也逐渐开始有实验室采用相关方法来进行血液动力学的研究. 现在根据他们的一篇简单综述Quantitative two-photon imaging of blood flow in cortex 和 Liis Lindvere等人在cold spring harbor protocol上发表的Two-Photon Fluorescence Microscopy of Cerebral Hemodynamics 进行简单介绍. 这种方法主要是通过带有Dextran的染料对血液进行染色来进行的. 带有Dextran的荧光染料能够将血液染色,但是无法进入到血红细胞RBC中, 因此在荧光激发下, 血液发出荧光,而血红细胞则为黑色. 本法可以通过测量黑色的血红细胞的速度RBC volecity和血管直径vessel diameter.径,进而计算出血流量flux等参数.另外, 又因为双光子显微镜在活体条件下很深的穿透力以及很高的空间分辨率,使得本法与传统的多普勒法测血液动力学相比优势相当突出.



[染料]: 一般采用尾静脉注射Dextran荧光染料:
        FITC-dextran (500KDa): 0.1ml 5%(w/v) 
        Texas Red dextran (70KDa) in PBS,C57BL/6 transgenicmice (H-line) 3-5 months (Zhang 2005,The Journal of Neuroscience, June 1, 2005 • 25(22):5333–5338 • 5333)
        FITC-dextran (70 kDa) in ACSF : 100ul-150ul, 20mg/ml,Male FVB/NJ mice 5-7 weeks  (Ding-2008,GLIA 57:767–776 (2009)
        FITC dextran (10 kDa) in pbs,0.5 ml, 0.5%, male Sprague–Dawley rats, 210–240 g (Kleinfeld,1998,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998))

       di-stryl benzene derivative, in Pluronic block copolymers. 一种新的纳米染料, 分子20-100 nm大小, 据测试在血管肿瘤区域也不会泄露.(J. Biomed. Opt. 16, 036001 (Mar 01, 2011); doi:10.1117/1.3548879).
[测量]
1. 本法可以测量血管网络的三维结构. 如下图,本人的在小鼠皮层中获得的结果,可以清楚的重构出皮层下数百微米的毛细血管形态(左图绿色为Astrocytes).
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2. 测量红细胞RBC的运动
采用line scan 扫描. 需要一定的象素分辨率和时间分辨率.如 Typically scanned a distance of 38 mm with a spatial resolution of 0.7 mm per pixel, a temporal resolution of 2 msec per scan, and a record length of 128 sec.
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如上图 B中沿着血管方向的蓝色和红色线进行line scan可获得D图中带有斜纹的velocity数据. 如E图左侧测量斜纹的每个斜纹的斜率即可算出速度(如果采样时间较长, 斜纹过多,采用手动计算斜率太繁琐和耗时, 可采用数字图像处理的方式进行计算,有空另行介绍). 如图B中垂直血管走向的绿色和黄色分辨可以测量出两个血管的直径变换, 一般来说动脉因为有平滑肌所以会收缩, 静脉的血管直径一般不变(F图). 图E采用半宽FWHM在数字图像中测量血管直径(技术方法另行介绍).

[计算公式]
在毛细血管中, 
RBC的即时速度Velocity: V= Δx/Δt;
Flux =1/△t; 
Linear density: ρ =1/△x;
因此: F= ρV

Spead: 0 - 1 mm/sec; independent of the caliber of the vessels ;The speed exhibited a weak but significant dependence on depth, with blood flow in deeper vessels tending to be slower.

Flux: 0 - 100 1/sec; 

vessels diameters:5-7 um.

Δspead/Δflux = 14 ± 2 um


在大血管中,涉及到流体动力学的问题,情况较为复杂.
对于在均一的直管内的非脉冲式层流, 流速(flow rate,即单位时间内的体积)是由Poiseuille's 方程得出的.因此,类似于此的血液循环系统也应可以使用该公式.
对于一段长为L,半径为R,阻滞系数为η , 血压差为△P 的血管, 根据以下方程可以得出,血流在血管内是中间快,靠近血管壁慢.

对于血管某一截面的平均速度有: 
<V> = V(0)/2 ,V(0)为血管中心速度.