酒窖窖池的微生物是如何培养出来的?
(2010-09-15 14:49:42)
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老窖酒全凭窖池里培养的神秘微生物,微生物越多酒越好。所以窖池成了国宝。但是,长期使用的窖池里的微生物是哪里来的呢?查遍所有资料都讳莫如深绝口不提。只说我的窖池多么古老,微生物多么多么多,近日百度沂河在一酒桌上得到一绝密消息,也算是酿酒专业人士酒后吐真言吧,他说这些微生物其实并不神秘,来源也很普通,但是绝对偶然,相传很久以前,某酒厂大量发酵粮食时窖池不够用,把酒厂外围的大便池拿来凑数,就这么无心之举酿出了神来之笔,就和电影红高粱一样,撒泡尿酿出好高粱酒一个道理,但是这事儿作为绝密只在酒厂里传播,江湖绝无半点泄露。所以各位今日读到消息千万哈哈一笑过后算完。酒桌上的笑话当不得真的。
酿酒老窖是一特殊的生态环境,沪型酒的浓香型与老窖泥中栖息的大量厌氧细菌有密切的关系“,。1936年Barker〔6,等人研究甲烷发酵时,偶然发现产己酸的细菌。后北原觉雄团研究己酸发酵,发现发酵液同时产生甲烷。1964年,原西南生物研究所在研究己酸菌富集培养时也观察到类似现象。
四川宜宾五粮液酒厂百年以上窖池中六大厌氧菌群的数量分布、生态结构的研究,发现甲烷菌在老窑中具有一定数量。其中厌氧异养菌、己酸菌的数量分布是随窖龄而增加,厌氧异氧菌、甲烷菌、己酸菌的菌数又随窖池的上、中、下层的顺序而递增。在传统工艺的长期影响下,在老窖发酵方面形成了一个相对稳定的化学生态环境和固有的微生物区系生态结构,它是生产五粮液名酒的基础。本研究工作进一步揭示了窖泥甲烷菌和己酸菌相互关系的存在,对提高浓香型酒主体香己酸乙酯的含量,突出五粮液名酒的香型具有重要意义.
自酿酒老窖窖泥中分离出一株革兰氏阳性的产甲烷菌。菌体为长杆状,0.5×2—5.5μm,单个或少数成对,有时连成长链。滚管菌落丝状,黄褐色。细胞对青霉素、红霉素、卡那霉素和四环素具有抗性。该菌株不能利用甲酸、甲醇、乙酸和三甲胺,只能以H_2-CO_2作为生长和产甲烷的基质。窖泥浸出液和微量元素维生素复合液显著刺激生长,酵母膏无刺激作用。生长最适温度35℃,最适pH7。在最适条件下振荡培养,最短增代时间约6小时,该菌鉴定为布氏甲烷杆菌,名称为CS菌株(Methanobacterium
bryantii CS)。
硕士论文:
中国浓香型白酒窖池微生物生态研究 向文良
【摘要】:利用PBS缓冲液富集窖池出窖醅样中的微生物菌体,通过玻璃珠法破碎菌体细胞,提取染色体DNA。然后在分子分类水平上,运用PCR扩增技术、质粒重组技术和克隆技术构建窖池原核微生物基因组文库,利用末端终止法测定16S
rDNA基因全序列。根据与基因数据库中相似菌群的16S
rDNA序列同源性比较和各菌群的系统发育分析建立系统发育树图。结果发现:当浓香型窖池中酒醅发酵60d后,由于生存环境恶劣窖池中发酵前期和中期中常见的微生物已不复存在,而仅存一些耐受力强的微生物。这些微生物分布为:上层分布有细菌和古菌。在系统发育树图上,上层细菌主要分为6个群系:TM7
phylum sp群、低G C%革兰氏阳性Lactobacteria群、低G C%革兰氏阳性Clostridiaceae群、低G
C%革兰氏阳性Paenibacillaceae群、高G
C%革兰氏阳性Corynebacteria群、革兰氏阴性Bacteroidete菌群。其中Lactobacteria群在窖池约占上层醅样细菌的36%。上层古菌主要为产甲烷菌,系统发育图上分为亲缘关系极近的两簇:Methanoculleus
oldenburgensis和Methanoculleus olentangyi为一簇,Methanospirillum
hungatei为一簇。它们都属于Methanomicrobiaceae属,其中前者和后者分别约占上层古菌的80%和20%。在窖池中心部位仅有细菌分布,在系统发育树图上主要分为4个菌群,高G
C%革兰氏阳性Actinobacteria群、低G
C%革兰氏阳性Lactobacteria群、Fusobacteria群、革兰氏阴性Protebacteria群,其中,β-Protebacteria群约占窖池中层醅样中原核微生物的80%。下层醅样中无细菌分布,仅有一种古菌,即Methanoculleus
oldenburgensis。 四川大学了吹_l:学位论文 在窖池原核微生物系统发育分析基础之上,进一步对不同空间位置微生物
生存环境的生态因子作了动态分析。分析结果表明:温度在窖池酒酷入窖后0~
7d阶段,上层由27’C降到23℃左右,中层由16℃升到23左右,下层基本维持
在入窖时的22℃。发酵约14天左右各层温度达到最高约32~34℃,以后一直
维持到主发酵期结束刁‘开始逐渐缓慢下降。PH值在窖池中相对稳定,各层一 般维持在pH3
.5左右,而总酸却随发酵时间的增长而升高,窖池中底层酸度高 于其它各层。出窖时各层酸度最高,约35度。总糖在酒酷中一直呈下降趋势,
其中各层含量下降主要发生在主发酵阶段。上层由发酵初的约28%降到20%左
右,中层由初期的约35%降到23%左右,下层由于可发酵糖已利用完全,因此
在整个过程中下层总搪除约有波动外皆维持在发酵初的17%左右。还原糖在发
酵初期各层增加最快,各层其含量也达到最高,上层、中层和下层平均分别达
到86%、6.2%和9.5%左右。进入主发酵期,各层的还原糖含量迅速降低,主
发酵期后阶段各层还原糖略有上升,但是到主发酵结束后还原糖随发酵时间的
推移,逐渐下降至最低,上层平均约1.5%,中层平均约3.7%,下层平均约4.9
%。乙醇是酒酷发酵过程中微生物生命活动关键的限制因素之一。在主发酵结
束后,上层酩样中乙醇平均含量约为5.0%,中层约为5.5%,下层约为5.3%。
窖池中水分含量在发酵过程中基本维持平衡,上层和中层约55%,‘下层约60
%。粗蛋白和醋在发酵过程中呈波动变化,粗蛋白一般维持在5%左右。醛在
发酵初期7的左右含量最高,每1009酷样中平均上层约含92mg、中层约含 76mg、一卜层约含1
00mg。在主发酵期醛含量迅速降低,至主发酵结束是培养中 醛含量基本保持在每1009酷样含20一30mg。
窖池微生物生态系统是窖池微生物和窖池特定环境相互作用的一个动平衡 系统。分析微生物在窖池中的区系分布和窖池中微生物菌群的系统发育,弄清
影响窖池微生物分布及演变的各种环境因素,对于理解发酵过程中的生化代谢
途径,建立窖池微生物生态数据库,实现窖池微生态系统的人工模拟和名优白 酒的扩大再生产具有重要意义。 关键词:窖池微生物生态、165
rDNA基因序列分析、原核微生物系统发育 分析、窖池环境生态因子分析
特曲属大曲浓香型
大曲:以小麦为原料,经粉碎后制成曲坯,让自然界微生物生长繁殖而成,称为大曲.
一、大曲的特点
大曲是酿制大曲酒用的糖化发酵剂。在制曲过程中依靠自然界各种微生物富集到用淀粉质原料制成曲坯上,经过扩大培养,形成各种有益的酿酒微生物菌糸和酶系,再经过风干、贮藏,即成为成品大曲。刚培养结束出房后的大曲,一般要经过三个有左右的贮存才能使用,每块大曲的重量在
2---3 公斤,含水量在 13 — 15% 左右。
大曲有以下几个特点:
1
、生料制曲用来制造大曲的原料应含有丰富的碳水化合物(主要是淀粉)、蛋白质及适量的无机盐等,以便在微生物生长繁殖过程中能提供必需的营养,同时对微生物的富集和不同酶的产生起到筛选与诱导作用。我们可以把大曲看作一种微生物的选择培养基,也是一种复合酶制剂的粗制品。生料制曲是大曲生产的一大特点,这不仅有利于保存原料中所含的水解酶类(如小麦麸皮中的β-淀粉酶)有助于大曲酒酿造进程中淀粉的糖化作用,而且有利于那些能在直接利用生料的微生物得以富集生长。一般我国南方的曲酒厂大多以小麦作为制曲的主要原料,北方常以大麦、豌豆为制曲原料。小麦制曲容易管理,淀粉含量丰富,还含有较多的面筋质,粘着力强,最适合于曲霉菌的生长。大麦皮多、粘性小、疏松,曲块成型后内部间隙大、上火慢、后火快,水分和热量散发也快,影响微生物在曲块内充分的繁殖;而豌豆粘着力强,蛋白质含量丰富,并含有香草醛和香草酸等清香物质,有利于清香的形成。由于豌豆粉结块后水分和热量不易散失,同样不利于微生物充分繁殖。因此制曲时大麦与豌豆必须进行适当的配比,才能制成好曲。有时用小麦制曲时,为了疏松曲块、提高微生物对酿酒原料的适应性,提高曲的质量,可添加
5 — 10 %的高粱。
2 、自然接种
大曲通过自然接种使周围环境中的微生物转移到曲块上繁殖,但自然界中微生物的分布往往又受到季节的影响,根据经验一般春未夏初到中秋季节是曲的最佳时期,此时环境的温、湿度较高,有利于曲室培养条件的控制。自然接种不仅为大曲提供丰富的微生物类群,而且这些微生物所产生的各种酶类形成了大曲的液化力、糖化力、蛋白质分解力和酒精发酵力。在制曲过程中,微生物分解原料所形成的代谢产物,如氨基酸,阿魏酸等都是大曲酒香味成分的前体物质,它们与发酵过程中形成的其它代谢产物一起,构成了大曲酒的各种香气和口味物质。
3 、大曲既是糖化发酵剂又是酿酒原料的一部分
在酿造大曲酒时,依靠大曲中存在的各种微生物和酶,对原料成分进行糖化发酵,同时大曲本身所含的淀粉、蛋白质等成分在发酵过程中也被分解利用。
4 、强调使用陈曲
大曲经过曲房培养后,即使成熟也不应立即使用,需要经过 2 — 6
个月的贮藏,成为陈曲后才投入使有。因为在制曲过程中潜入了大量产酸细菌,它们在干燥条件下会大部分死亡或失去繁殖能力,以减弱发酵过程中的产酸能力。同时在大曲通过适当贮存中酵母数量是也会减少,酶活适当钝化,在今后酿酒过程中可避免前火猛、升酸快的情况
二、大曲的类型
根据制曲过程中控制曲块最高品温的不同,一般把大曲分为高温曲和中温曲。高温曲的最高制曲品温达 60
℃以上,主要用于生产茅香型(俗称酱香型大曲酒)和泸香型(俗称浓香型)大曲酒。中温曲的最高制曲品温一般不超过 50
℃,它主要用来生产汾香型(俗称清香型)大曲酒,某些泸香型曲酒为了提高曲和酒的香味,从六十年代中期开始逐渐将制曲温度升高订为 55 —
60
℃,成为偏高温曲。为了提高酒的香气,除汾酒大曲和董酒麦曲外,绝大多数名、优酒厂都倾向于高温制曲。各有关酒厂制曲的最高品温控制如下:
各厂除了在制曲温度的控制上不同外,在制曲原料的配比上也不一样,典型的高温曲常采用纯小麦制曲,而其他的大曲常以小麦为主、添加不同比例的大麦和豌豆,用以调节曲块的粘结性和增加香味;典型的中温曲常以大麦、豌豆作为制曲的原料。
高温曲的典型代表是茅台大曲,其显著的工艺特点是“堆曲”,即在制曲过程中,用稻草隔开的曲坯堆放在一起,以提高曲坯的培养温度,使品温度达
60
℃以上,称为高温堆曲;而中温曲的典型代表汾酒大曲,制曲工艺看重于排列,操作严谨保温、保潮、降温各阶段环环相扣,控制曲坯品温最高不超过
50 ℃。
制曲温度的高低直接影响大曲中各类微生物的生长繁殖,微生物在曲坯上进行生长繁殖,有其大致的规律,前期以霉菌和酵母大量繁殖为主,中期是霉菌从曲坯表面向内部繁殖,而后期由于温度升高酵母和不耐热的细菌营养体大量死亡,而嗜热芽孢杆菌和少量的耐温红曲仍存活。因此,中温曲所含的微生物以霉菌、酵母为主,高温的茅台大曲中很难分离到酵母菌,而耐高温的芽孢杆菌较多。
对于成品大曲的理化性能的比较,可以发现高温曲水分偏低、酸度较高、氨基酸含量比较多、糖化力和发酵力弱、液化力稍强、出酒率低、酒质醇厚、酱香浓,中温曲相对水分稍高、酸度偏低、糖化力发酵力强、出酒率较高,而曲的香气较淡。不同类型的大曲在酿酒过程中表现不同的生化性能。因此,各类大曲可以分别制备混合使用来兼顾大曲酒的产、质量。
大曲酒——是指用大曲为糖化发酵剂酿制的酒。大曲酒的曲呈砖块状,是选用小麦、大麦、豌豆等原料,经粉碎、加水搅拌、压制而成。然后在室温45-70度经过25-40天自然培养或加入曲母培养,使微生物相互接种最终制成。因其体积大、呈大砖状故得名“大曲”。大曲酒有:茅台、汾酒、泸州老窖、西风、杜康等等。
二曲酒(或称小曲酒)——是指用小曲为糖化发酵剂酿制的酒.小曲酒的曲呈小方块状,是选用大米为原料,加入少量的辣蓼草粉末,在室温25-30度经7-15天菌种培养制成。因其体积小故名“小曲”。小曲酒有桂林三花、浏阳河、广东米酒等。
另外还有麸曲酒——是指用麸曲和酒母为糖化发酵剂酿制的酒。麸曲呈松散状,用麸皮制作,故称麸曲。如凌川白酒、六曲香等。
纵观世界各国用谷物原料酿酒的历史,可发现有两大类,一类是以谷物发芽的方式,利用谷物发芽时产生的酶将原料本身糖化成糖份,再用酵母菌将糖份转变成酒精;另一类是用发霉的谷物,制成酒曲,用酒曲中所含的酶制剂将谷物原料糖化发酵成酒。从有文字记载以来,中国的酒绝大多数是用酒曲酿造的,而且中国的酒曲法酿酒对于周边国家,如日本、越南和泰国等都有较大的影响。因此在讲述中国酒的品种及特征之前,有必要对中国的酒曲作一个较详细的了解。
虽然中国人民与曲蘖打了几千年的交道,知道酿酒一定要加入酒曲,但一直不知道曲蘖的本质所在。现代科学才解开其中的奥秘。酿酒加曲,是因为酒曲上生长有大量的微生物,还有微生物所分泌的酶(淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等),酶具有生物催化作用,可以加速将谷物中的淀粉,蛋白质等转变成糖、氨基酸。糖分在酵母菌的酶的作用下,分解成乙醇,即酒精。蘖也含有许多这样的酶,具有糖化作用。可以将蘖本身中的淀粉转变成糖分,在酵母菌的作用下再转变成乙醇。同时, 酒曲本身含有淀粉和蛋白质等,也是酿酒原料。
酒曲酿酒是中国酿酒的精华所在。酒曲中所生长的微生物主要是霉菌。对霉菌的利用是中国人的一大发明创造。日本有位著名的微生物学家坂口谨一郎教授认为这甚至可与中国古代的四大发明相媲美,这显然是从生物工程技术在当今科学技术的重要地位推断出来的。随着时代的发展,我国古代人民所创立的方法将日益显示其重要的作用。
酒曲的种类
酒曲的起源已不可考,关于酒曲的最早文字可能就是周朝著作《书经·说命篇》中的“若作酒醴,尔惟曲蘖”。从科学原理加以分析,酒曲实际上是从发霉的谷物演变来的。酒曲的生产技术在北魏时代的《齐民要术》中第一次得到全面总结,在宋代已达到极高的水平。主要表现在:酒曲品种齐全,工艺技术完善,酒曲尤其是南方的小曲糖化发酵力都很高。现代酒曲仍广泛用于黄酒,白酒等的酿造。在生产技术上,由于对微生物及酿酒理论知识的掌握,酒曲的发展跃上了一个新台阶。
原始的酒曲是发霉或发芽的谷物,人们加以改良,就制成了适于酿酒的酒曲。由于所采用的原料及制作方法不同,生产地区的自然条件有异,酒曲的品种丰富多彩。大致在宋代,中国酒曲的种类和制造技术基本上定型。后世在此基础上还有一些改进。以下是中国酒曲的种类:
一 酒曲的分类体系
按制曲原料来分主要有小麦和稻米。故分别称为麦曲和米曲。用稻米制的曲,种类也很多,如用米粉制成的小曲,用蒸熟的米饭制成的红曲或乌衣红曲,米曲(米曲霉)。
按原料是否熟化处理可分为生麦曲和熟麦曲。
按曲中的添加物来分,又有很多种类,如加入中草药的称为药曲, 加入豆类原料的称为豆曲(碗豆,绿豆等)。
按曲的形体可分为大曲(草包曲,砖曲,挂曲)和小曲(饼曲),散曲。
按酒曲中微生物的来源, 分为传统酒曲(微生物的天然接种)和纯种酒曲(如米曲霉接种的米曲,根霉菌接种的根霉曲,黑曲霉接种的酒曲)。
二 酒曲的分类
现代大致将酒曲分为五大类,分别用于不同的酒。它们是:
麦曲,主要用于黄酒的酿造;
小曲,主要用于黄酒和小曲白酒的酿造;
红曲,主要用于红曲酒的酿造(红曲酒是黄酒的一个品种);
大曲,用于蒸馏酒的酿造。
麸曲,这是现代才发展起来的,用纯种霉菌接种以麸皮为原料的培养物。可用于代替部分大曲或小曲。目前麸曲法白酒是我国白酒生产的主要操作法之一。其白酒产量占总产量的70%以上。