斑点金免疫渗滤试验快速检测抗Hp细胞毒素相关蛋白A抗体

    1第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所 陕西省西安市 710033

    2西安市中心医院消化内科 710006

    韩锋产，男，1963-05-08生，陕西省咸阳市人，汉族. 1985年延安大学医学系毕业，1990年西安医科大学生物化学专业硕士研究生毕业，1995年入第四军医大学攻读生物化学专业博士研究生，主要从事基因诊断方面的研究工作，发表论文8篇.

    项目负责人 韩锋产，710033，第四军医大学全军基因诊断技术应用研究所，陕西省西安市长乐西路17号.

    Correspondence to Feng-Chan Han, Institute of Genetic Diagnosis, Chinese People＇s Liberation Army, Fourth Military Medical University, Xi＇an 710032, Shaanxi Province, China

    Tel. +86·29·3285729

    收稿日期 1997-11-25 接收日期 1997-11-28

    Dot immunogold filtration assay for anti-Helicobacter pylori antibody

    Feng-Chan Han1, Xiao-Jun Yan1, Li Zhang2, Yu Hou1, Cheng-Zhi Su1, Ling-Xia Zhang2 and MeiJiang2

    Institute of Genetic Diagnosis, Chinese People＇s Liberation Army, Fourth Military Medical University,Xi＇an 710032, Shaanxi Province, China

Abstract

    AIM To establish a dot immunogold filtration assay (DIGFA) for the detection of Helicobacter pylori (Hp) cytotoxin associated protein A (CagA).

    METHODS The CagA antigen was dotted on nitrocellulose membrane to capture the anti-CagA IgG from serum. Then the patients＇ serum and the colloidal gold particles labelled with anti-human IgG antibody were added separately. The IgG was revealed by a red dot.

    RESULTS DIGFA could be completed in several minutes. When 108 serum samples were detected with DIGFA and EIA, there were no remarkable differences between the two methods. The sensitivity and specificity were 94% (45/48) and 98% (57/58) when the results of polymerase chain reaction (PCR) for CagA of Hp in gastric biopsy specimens were taken as the standards.

    CONCLUSION This method is rapid, sensitive and specific, and could be widely used in detecting the infection of CagA positive Hp.

    Subject headings Helicobacter pylori; antibodies, bacterial; cytotoxin associated protein A; immunohistochemistry

    Han FC, Yan XJ, Zhang L, Hou Y, Su CZ, Zhang LX, Jiang M. Dot immunogold filtration assay for anti Helicobacter pylori antibody.

    Huaren Xiaohua Zazhi,1998;6(5):407-408

    摘要

    目的 建立快速检测抗幽门螺杆菌(Hp)细胞毒素相关蛋白A(CagA)的斑点金免疫渗滤试验(DIGFA).

    方法 将CagA抗原点于硝酸纤维素膜上，然后依次加入患者血清及用抗人IgG抗体标记的胶体金颗粒，如血清中存在抗CagA的IgG，在膜上便出现一个红色斑点.

    结果 DIGFA仅需几分种便可完成. 当用DIGFA及EIA对108份血清进行检测时，两种方法之特异性及敏感性相当. 当以聚合酶链反应(PCR)检测胃粘膜组织中Hp CagA的结果作为参照时，DIGFA的特异性及敏感性分别为98%(57/58)和94%(45/48).

    结论 DIGFA特异性强，敏感度高，操作快速且简便，在CagA阳性Hp感染的检测方面有广泛应用前景.

    主题词 螺杆菌，幽门；抗体，细菌/分析；细胞毒素相关蛋白A；免疫组织化学

    韩锋产, 阎小君, 张沥, 侯瑜, 苏成芝, 张玲霞, 江梅.斑点金免疫渗滤试验快速检测抗Hp细胞毒素相关蛋白A抗体.

    华人消化杂志,1998;6(5):407-408

    0 引言

    已知人群中幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, Hp)的感染率在50%以上，其中60%～80%的Hp具有单拷贝的细胞毒素相关蛋白基因A(cytotoxin associated protein gene A, CagA)，产生细胞毒素相关蛋白A(CagA). 研究表明，产生CagA的Hp与消化系统疾病的关系十分密切[1，2]. 故早期及快速诊断CagA阳性Hp的感染对指导治疗有重要意义. 我们拟建立斑点金免疫渗滤试验(dot immunogold filtration assay, DIGFA)检测抗Hp-CagA IgG的方法.

    1 材料和方法

    1.1 材料 ①Hp细胞毒素相关蛋白A(CagA)为基因工程产品，由美国Vanderbilt大学卜昕博士惠赠. ②羊抗人IgG冻干血清购于卫生部上海生物制品所，批号950301，抗体的提取及纯化参照文献[3]. ③患者血清及胃粘膜活检标本由西安市中心医院消化内科提供. ④PCR检测胃粘膜组织Hp CagA基因试剂盒由本所制备. ⑤EIA检测抗Hp-CagA IgG试剂盒购自上海晶莹生物技术有限公司. ⑥氯金酸为成都化工厂产品，分析纯. ⑦硝酸纤维素(NC)膜购于北京化工大学，孔径0.65μm.

    1.2 方法 ①原理：将待检血清加于预先包被有CagA的微孔滤膜上，将羊抗人IgG结合于胶体金颗粒表面，若血清中含有IgG抗CagA抗体，则形成CagA-IgG-抗IgG，在膜上形成肉眼可见的红色斑点. ②胶体金的制备：将0.48mmol/L的氯金酸100ml加热至沸，在搅拌状态下迅速加入34mmol/L柠檬酸三钠4.0ml，继续加热7min，使体系呈葡萄红即为金溶胶. 电镜观察金颗粒直径为15nm. ③免疫胶体金的制备参考文献[4]进行. 主要过程如下：取金溶胶1ml，用0.1mol/L K2CO3调pH至9.0，每毫升胶体金加入羊抗人IgG 40μg，混合10min，加入BSA至10g/L，混合5min，弃上清，用5g/L BSA-PBS 0.3ml悬浮沉淀，即为所制备的免疫胶体金. ④微孔滤膜处理及抗原固化：NC膜先用三蒸水浸泡，取出凉干，用打孔器制成直径为1cm 的圆片，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液浸泡，凉干后，将1μl CagA溶液点于膜中央，室温干燥后，用5g/L BSA封闭，然后用PBS-T洗涤2次，每次10min，干燥后，装入自制的免疫渗滤装置板内. ⑤试验方法：将免疫渗滤板取出，对应血清编号，在膜中央点一滴0.01mol/L PBS-T 洗涤液活化NC膜，待渗入膜内后，取血清10μl缓慢加于膜中央，用洗涤液2～3滴冲洗，然后加入胶体金标记物30μl，待渗入后，再加洗涤液2～3滴冲洗. 阳性者在膜中央出现红色斑点，否则为阴性. ⑥EIA法检测抗Hp-CagA IgG按使用说明操作. ⑦CagA基因的PCR扩增组织Hp DNA提取参照文献[5]进行. CagA的PCR扩增引物序列为：C1:5＇-AATACACCAACGCCTCCAAG-3＇；C2:5＇-TTGTTGCCGCTTTTGCTCTC-3＇，扩增片段为400bp.

    2 结果

    2.1 DIGFA与EIA和PCR方法的比较 对108份胃粘膜活检组织作Hp CagA的PCR检测，其中48份CagA阳性，58份阴性. 对48例胃粘膜组织CagA阳性的患者之血液作DIGFA及EIA检测，血清抗CagA IgG阳性者分别为45例及46例；对58例胃粘膜组织CagA阴性患者血清作DIGFA及EIA，血清抗CagA阳性者分别为1例及3例. 若以PCR检测作为参照标准，则DIGFA的特异性为(57/58) 98%，灵敏度为(45/48) 94%；EIA检测的特异性为(55/58) 95%，敏感度为(46/48) 96%. DIGFA与EIA之特异性及敏感度间均无显著性差异.

    2.2 重复性试验 随机选择阳性及阴性标本各10份，重复5次均可判定出相同结果.

    3 讨论

    目前，诊断Hp感染有两大类5种方法：①创伤性：包括组织活检镜检，培养及PCR等. ②非创伤性：包括尿素酶呼吸试验及ELISA等方法. 创伤性检测虽然直观，但费时，患者痛苦大，故非创伤性检测Hp是一个发展的方向. 尿素酶呼吸试验费用昂贵，一般人难以接受，而ELISA法也存在操作复杂等不足. 斑点金免疫渗滤试验是近几年发展起来的免疫检测新技术，因微孔膜既能吸附蛋白质，又具有快速渗滤及毛细血管作用. 当血清标本通过微孔滤膜时，血清中的抗原或抗体不仅能与膜上的抗原或抗体结合，还能浓集于膜上而加快免疫反应. 且胶体金标记物为红色，结合后即显红色斑点，不需加入其他试剂显色. 本文结果表明，DIGFA除具有EIA之特异性及敏感度外，其另一个显著特点是快速、简便，一般可以在2min～3min内出结果，并可单人份或多人份操作.

    研究表明，血清抗CagA IgG与消化性溃疡关系十分密切，甚至有人认为抗CagA IgG阳性可以作为十二指肠溃疡的一项参考指标看待[6，7]. 研究还发现，能产生CagA的Hp菌株在胃癌组织有较高的感染率[2,8]. 故本文所建立的检测血清中抗CagA IgG的方法无疑对于CagA阳性Hp感染的快速诊断有重要意义.

    为适应大面积及大样本的CagA阳性Hp的筛查，发展廉价，易普及的诊断试剂及方法非常必要，为此本所已在大肠杆菌中成功地表达了CagA，为该方法的推广应用提供了保证。【提供第四军医大学研制的生物芯片临床诊断产品：医院生物芯片诊断工作平台、唐氏综合征产前筛查检测芯片、优生优育TORCH抗体检测芯片、免疫性不孕不育抗体检测芯片、宫颈癌HPV的靶向性细胞检测、呼吸道病毒感染抗体检测芯片、性传播疾病抗体检测芯片、幽门螺杆菌Hp抗体谱检测芯片、心血管病感染因子抗体检测芯片、微生物芯片分析系统平台、高通量药物侦检系统（哈姆斯-HMTS）平台、心肌梗塞联检生物芯片、乙肝表面抗原及e抗原定量检测芯片。若加入向日葵爱芯医院行动计划，可免费获得60万元的生物芯片工作平台。】【提供生物芯片北京国家工程研究中心研制的科研和医学产品：生物芯片整体解决方案、兽药残留芯片检测系统、食品安全芯片检测解决方案，合作共建研究中心服务、生物芯片实验室建设服务、芯片平台建设，生物芯片扫描仪、芯片杂交仪等仪器，耳聋基因芯片、乙肝病毒耐药检测芯片、抗核抗体检测蛋白质芯片、结核分枝杆菌耐药检测芯片、G+细菌鉴定与耐药检测基因芯片等，食源性致病微生物检测试剂盒、兽药残留芯片检测试剂盒等，HLA基因分型检测方案、血小板基因分型。】【请索取产品项目资料：虫洞（北京）卫生科技有限公司，戴天岩 经理，手机：13051069337，E-mail:davad311@126.com，msn:davad311@hotmail.com,qq:104974415，虫洞医学与生命科学网http://blog.sina.com.cn/cnyr】

    4 参考文献

    1 Blaser MJ, Perezperez GI, Kleanthous H, Cover TL, Peek RM, Chyou PH et al.Infection with Helicobacter pylori strains  possessing CagA is associated with an increased risk of developing adenocarcinoma of the stomach. Cancer Res, 1995;55(5):2111-2115

    2 Queiroz DMM, Mendes EN, Rocha GA, Soarres TF, Limajr GF, Oliveira CA et al.H.pylori strains possessing CagA and vacuolating  cytotoxin producers are associated to both types of gastric carcinoma.Gastroenterology,1996;110 (Suppl):A236

    3 蔡文琴，王伯云，主编. 实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术. 第1版. 成都：四川科学技术出版社，1994：46-48

    4 肖乐义，闫小君，徐德忠，韩锋产，苏成芝，侯瑜. et al. 斑点金免疫渗滤试验快速检测抗甲型肝炎病毒IgM抗体. 第四军医大学学报1996；17(6)：441-443

    5 Hammar M, Tyszkiewicz T, Wadstrom T. Rapid detection of Helicobacter pylori in gastric biopsy material by polymerase chain reaction. J Clin Microb, 1992;30(1):54-58

    6 Lage AP, Godfroid E, Fauconnier A, Burette A, Butzler JP, Bollen A et al.Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR comparison with other invasive techniques and detection of the CagA gene in gastric biopsy specimens. J Clin Microbiol, 1995;33(10):2752-2756

    7 Ching CK, Wong BCY, Kwok E, Ong L, Covacci A, Lam SK. Prevalence of CagAbearing Helicobacter pylori strains detected by the  anti CagA assay in patients with peptic ulcer disease and in controls. Am J Gastroenterol, 1996;91(5):949-953

    8 阎小君，张沥，韩锋产，张玲霞，苏成芝. 细胞毒素相关蛋白基因A与胃粘膜组织恶变的研究. 胃肠病学，1997；2(3)：158-161 (韩锋产1 阎小君1 张沥2 侯瑜1 苏成芝1 张玲霞2 江梅2)