图：江西省人民医院

          采用组织芯片技术研究宫颈癌中HPV与细胞周期调控因子p27表达的关系

                  
                        陈丽霞 沈燕如 罗文群 赖云英 罗斌华 刘勇

【摘要】  目的 研究 宫颈癌组织中HPV感染与细胞周期调控因子p27表达的关系及意义。 方法 采用组织芯片技术制作60例宫颈癌组织芯片，同时用S-P免疫组织化学和原位分子杂交方法检测宫颈癌组织芯片中HPV、p27、p27 mRNA的表达。结果 60例宫颈癌组织中HPV、p27、p27 mRNA的阳性率分别为48.3%、38.3%、51.7%。淋巴结转移阳性宫颈癌中p27和p27 mRNA阳性率明显低于淋巴结转移阴性宫颈癌（P＜0.01）。淋巴结转移阳性宫颈癌中HPV阳性率明显高于淋巴结转移阴性宫颈癌（P＜0.05）。宫颈癌和CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变组织中HPV阳性率明显高于CINⅠ级和CINⅡ级（P＜0.05）。而p27和p27 mRNA阳性率明显低于CINⅠ级和CIN Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织（P＜0.05）。宫颈癌中HPV与p27及p27 mRNA表达呈明显负相关（r=-0.574，P＜0.05；r=-0.612，P＜0.01）。结论 HPV感染和细胞周期调控因子p27低表达与宫颈癌密切相关。HPV感染与p27低表达有关。HPV和p27可作为评估宫颈癌预后的 参考 指标。 应用 组织芯片大规模高效检测临床组织样本是可行的，具有快速、方便、 经济 、准确的特点。

【关键词】  组织芯片 宫颈肿瘤 乳头状瘤病毒 细胞周期 p27

    ［Abstract］  Objective  To investigate the relationship between cell cycle regulation factor p27 and HPV in cervical cancer tissue.Methods  Sixty tissue chips of cervical cancer were made by tissue chip technique,S-P immunohistochemistry and in situ hybridization were simultaneously used to determine the expression of HPV,p27 mRNA in every tissue chip.Results  Positive rates of HPV,p27,p27 mRNA in 60 cervical carcinoma tissues were 48.3%，38.3% and 51.7% respectively .Cervical cancers that had no lymphatic metastasis were found to be significantly more likely to express p27 and p27 mRNA and showed lower positive rates of HPV than that had lymphatic metastasis （P＜0.01＆P＜0.05,respectively）. The tissue of cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia Ⅲ （CIN Ⅲ） showed obvious higher positive rate of HPV and lower positive rates of  p27 and p27 mRNA than the tissue of CIN Ⅰ and CIN Ⅱ （P＜0.05）.The expression of HPV showed obvious reverse correlation with that of  p27 and p27 mRNA in the tissue of cervical cancer（r=-0.574, P＜0.05;r=-0.612，P＜0.01）.Conclusion  Low expression of p27 and HPV infection are affinitive with cervical cancer and the HPV infection is due to the low expression of p27.HPV and p27 can be regarded as reference index used to estimate the prognosis of cervical cancer.

    ［Key words］  tissue chip;cervical cancer;papillomavirus,human;cell cycle;p27

    大量资料表明，人乳头状瘤病毒（HPV）感染与女性生殖道肿瘤特别是宫颈癌的发生有密切关系，尤其是HPV16型和HPV18型与宫颈癌的关系更为密切［1］。笔者制作了60例宫颈癌组织芯片，并采用免疫组织化学及原位分子杂交技术检测HPV、p27和p27 mRNA的表达，探讨宫颈癌组织中HPV感染与细胞周期调控因子p27表达的关系及其意义。

    1  材料与方法

    1.1  材料  从我院病理科档案材料中选取2002～2005年石蜡包埋宫颈癌标本60例，宫颈上皮内瘤变标本30例（其中CIN Ⅰ级10例、CIN Ⅱ级10例、CIN Ⅲ级10例），其中宫颈癌淋巴结转移阳性者38例。患者年龄32～67岁，平均52.8岁。所有切片均按WHO宫颈肿瘤分类标准进行复检。

    1.2  组织芯片制作［2］

    1.2.1  组织芯片空白蜡块的制备  将熔化石蜡制作成4.0 cm×2.0 cm×1.0 cm大小的空白蜡块，设计15×6的阵列，用打孔机根据设计打孔，孔径1.5 mm，即制成组织芯片空白蜡块。

    1.2.2  组织芯片的制备  将选取的组织蜡块放在45 ℃温箱中烘5～10 min,然后用打孔针在蜡块选定部位逐个取出组织芯片，随即按预先设计放入空白蜡块中。将制成的组织芯片面朝下放在铜板上，于55 ℃温箱中放置30 min，轻压模块使组织芯片在模块中排平，组织芯片即制成。将切好的组织切片平整地粘贴于载玻片上。一个组织芯片蜡块一般可切100张4～5 μm的连续切片。

    1.3  组织芯片免疫组化标记  单克隆抗HPV16/18-E6抗体（CIP5）为即用型工作液，单克隆抗p27抗体（DCS-72.F6）为即用型工作液，生物素-链霉菌卵白素检测系统（S-P）试剂盒，均购自福州迈新生物技术有限公司。3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，20%鸡蛋清封闭内源性生物素，严格按说明书步骤操作。DAB显色。PBS液代替一抗作阴性对照，以已知阳性切片作阳性对照。

    1.4  原位分子杂交［3］  p27 cDNA探针及生物素标记试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。主要实验步骤：（1）杂交前预处理；（2）暴露p27 mRNA核酸片段；（3）生物素标记的p27cDNA探针变性后同p27 mRNA杂交；（4）杂交后处理，DAB显色。上述过程均在无RNA酶条件下进行。PBS液代替探针作阴性对照，与已知阳性切片作阳性对照。

    1.5  结果判断［4］  染色阳性信号呈棕黄色，采用显微摄像 计算 机图像 分析 系统，计算组织芯片中阳性细胞和肿瘤细胞的数量。判断标准为：无阳性细胞为阴性（-）；阳性细胞<肿瘤细胞的50%者为阳性（+）；阳性细胞>肿瘤细胞的50%者为强阳性（++）。统计学分析采用χ2检验和spearman等级相关分析。

    2  结果

    2.1  HPV产物主要在细胞核内表达  宫颈癌组织中HPV阳性表达率48.3%，明显高于CIN Ⅰ级和 Ⅱ级宫颈上皮内瘤变组织，两者比较差异有显著性（P＜0.05）。

    CIN Ⅲ级宫颈上皮内瘤变组织中HPV阳性表达率明显高于CIN Ⅰ级和 Ⅱ级，两者比较差异有显著性（P<0.05）。淋巴转移阳性宫颈癌组织中HPV阳性表达率明显高于淋巴结转移阴性者，两者比较差异有显著性（P<0.05）。【提供服务：生物芯片整体解决方案、兽药残留芯片检测系统；生物芯片扫描仪等仪器；耳聋基因芯片、乙肝病毒耐药检测芯片、抗核抗体检测蛋白质芯片、结核分枝杆菌耐药检测芯片、G+细菌鉴定与耐药检测基因芯片等；食源性致病微生物检测试剂盒、兽药残留芯片检测试剂盒等；HLA基因分型检测方案、血小板基因分型；人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、家蚕全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、人肿瘤相关基因寡核苷酸微阵列芯片服务、miRNA微阵列芯片服务、DNA甲基化谱检测寡核苷酸芯片服务等；合作共建研究中心服务、生物芯片实验室建设服务、科研课题研究服务；糖尿病超强化治疗技术应用项目合作。请联系索取详细产品和服务介绍资料：医学与生命科学服务中心暨虫洞（北京）卫生科技有限公司，戴天岩  主任、总经理，手机：13051069337，E-mail:davad311@126.com，msn:davad311@hotmail.com,qq:104974415，虫洞医学与生命科学网http://blog.sina.com.cn/cnyr】