多基因寡核苷酸芯片在胰腺癌及胰腺良性病变标本检测中的应用

作者：郭树彬 杨红 伍东升 陆星华 钱家鸣 刘军波 王升启    作者单位：中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院急诊科，北京 100730

【摘要】  　　目的 建立kras、p16、DPC4、p53基因寡核苷酸芯片对胰腺癌基因突变/缺失的检测系统并评估胰腺癌组织及胰腺良性疾病标本中多基因突变/缺失在临床检测中的应用。方法 采用双重或单独不对称PCR扩增16例胰腺癌组织及8例胰腺良性疾病标本中的目的DNA。扩增产物加杂交液后与芯片进行杂交、清洗、扫描。结果 16例胰腺癌组织中12例可见kras突变，p16、DPC4、p53基因改变分别是7例。14例标本存在至少1个基因改变，其中5例标本存在1个基因改变，2例标本同时2个基因改变，4例标本存在同时3个基因改变，3例标本存在同时4个基因改变。8例胰腺良性疾病中只有3例显示kras、p16、p53、DPC4突变。结论 多基因芯片系统具有高度的灵敏性和准确性、快速简便、自动化程度高等优点，可同时检测胰腺癌kras、p16、DPC4和p53多个热点突变基因，可以高效地应用于胰腺癌基因突变的研究。 

【关键词】  寡核苷酸芯片 胰腺癌 kras p16 DPC4 p53基因

　　胰腺癌是一种恶性程度高，易转移且预后差的消化道肿瘤，其发生发展是多基因突变累积的结果。在以往胰腺癌相关基因研究中，主要是针对一些个别基因在胰腺癌中的表达变化；但无论是生理或病理过程中，每一个基因都不是独立发挥作用的。在胰腺癌的发生和发展过程中存在着互相协调的共表达的基因群，对胰腺癌进行基因群水平研究，筛选在肿瘤相关的多个环节上起作用的分子和起关键调节作用的基因，对揭示胰腺癌在基因群水平的变化及阐述胰腺癌发生的分子机制的本质，了解胰腺癌的发生、发展规律并有效地控制和治疗胰腺癌有着重要作用〔1，2〕。生物技术的进展及基因芯片技术的应用，使我们对多个基因的突变及基因群水平变化的研究成为可能〔3，4〕。本研究旨在利用寡核苷酸芯片技术对胰腺癌多个相关突变基因同时进行并行检测，探索基因群表达变化与胰腺癌及胰腺良性疾病生物学特性的内在联系与规律。

　　1  材料与方法

　　11  一般资料  本组16例胰腺癌组织标本来源于1999年9月～2002年5月北京协和医院、解放军301医院、宣武医院基本外科手术病人胰腺癌标本。胰腺良性病变手术标本8例，胰岛细胞瘤2例，慢性胰腺炎1例，胰腺黏液囊腺瘤3例，胰腺中高分化腺瘤2例。所有标本均有明确病理诊断，液氮冻存。

　　12  实验方法

　　121  组织标本DNA的提取及Klenow酶修饰补平制备靶标  应用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA，寡核苷酸05 mg，Klenow 10×Buffer 1 ml，02 mmol/L dNTP 2 ml，1 mg/ml Cy3标记引物1 ml，65℃变性5 min，冷却加入02 ml Klenow酶，反应10 min，10 ml的反应体系中90℃变性2～5 min，冰水冷却，加入不标记引物 (1 mg/ml)、 02 ml Klenow酶，室温10 min，75℃10 min，取出02 ml反应液作为模板进行PCR反应。PCR反应条件如下：变性94℃ 3 min；94℃ 30 s；退火54℃ 30 s；延伸72℃ 30 s;72℃ 5 min。不对称PCR扩增45个循环。2%琼脂糖胶电泳检测PCR产物。

　　122  芯片的制备  利用Pixy sys7500芯片仪将寡核苷酸喷到醛基化的玻片上，斑点之间间距为05 mm；点样完毕后，室温放置过夜。用含NaBH4的芯片处理溶液还原10 min，02%SDS洗、水洗，空气干燥后用于杂交；PCR产物2 μl，按1∶5比例稀释成10 ml杂交液，100℃水浴5 min，冰水混合物中10 min；混合液加到芯片上，50℃15 h；洗片、干燥、备扫描。

　　123  信号荧光检测及数据处理  杂交完毕后激光共聚焦荧光扫描仪ScanArray3000(General Scanning，Inc,Watertown，MA)检测，激发波长分别为585、650 nm。荧光信号定量采用Imagene40 (Biodiscovery,Inc) 软件进行。根据定量结果，按下列公式计算芯片上每一个点的比值：比值=校正系数×样品信躁比/野生型基因信躁比，其中校正系数=野生型模板中这一点所属外显子的所有点的信躁比之和/样品中对应的信躁比之和。如比值大于20或小于05，则表示这一点发生了突变。

　　2  结果

　　21  寡核苷酸芯片检测胰腺癌多基因改变  16例胰腺癌组织的kras、p53、p16及DPC4四种基因的突变及缺失总异常率为875%，其中kras基因突变75%；p53、p16及DPC4基因异常率均为437%；14例标本存在至少1个基因改变，其中5例标本存在1个基因改变，2例标本同时2个基因改变，4例标本存在同时3个基因改变，3例标本存在同时4个基因改变（表1）。在本组病例中，kras最频繁的突变位点是12密码子的第1和第2位碱基。p53的突变热点在248密码子的第2位碱基，249密码子的第3位碱基，213密码子第2位碱基，282密码子第1位碱基和273密码子的第2位碱基。p16基因突变位点在15密码子第2位碱基，43密码子第1位碱基和102密码子的第2位碱基。p16基因缺失位点主要发生在70密码子的第7位碱基和97密码子的第20位碱基。DPC4基因的热点突变发生在358密码子第1位碱基，412密码子第3位碱基，493密码子第1位碱基和515密码子的第1位碱基。DPC4基因缺失主要发生在516～518密码子的第8位碱基。

　　22  寡核苷酸芯片检测胰腺良性病变多基因改变  8例胰腺良性病变组织的总异常率为375%，2例胰岛细胞瘤标本的检测结果未发现有点突变发生。3例胰腺黏液囊腺瘤未检测出这4种基因改变。1例慢性胰腺炎存在kras、p53及DPC4基因突变和缺失，胰腺不同分化腺瘤也检测到有kras及p53基因突变（表2）。

　　表1  胰腺癌的基因突变与缺失分析（略）

　　表2  胰腺良性病变组织的基因突变和缺失分析（略）

　　No1、3：胰岛细胞瘤，No2：慢性胰腺炎；No4、8:胰腺腺瘤；No5、6、7：胰腺黏液囊腺瘤

　　3  讨论
   
　　本文结果提示胰腺癌的发生是多基因突变累积的结果。 应用基因芯片技术建立了对胰腺癌基因突变及缺失的检测系统，系统具有高度的灵敏性和准确性、快速简便、自动化程度高等优点，实现了对同胰腺癌相关的多个热点突变基因进行并行检测的设想，联合检测胰腺癌组织中kras、p53、p16及DPC4基因，可提高其检测的敏感性；因为病例数较少未作统计学处理，但从趋势上显示胰腺癌组织4种基因的异常率明显高于胰腺良性病变组织。
   
　　在8例胰腺良性病变标本中，2例胰岛细胞瘤标本的检测结果未发现有点突变发生，这一结果与Schmied等的报道结果相似〔5～7〕，本实验中的3例胰腺黏液囊腺瘤同样未检测出这4种基因突变,有关kras和p53基因在胰腺黏液囊腺瘤中的突变情况同以往的多家报道相一致〔8～10〕。
   
　　虽然有些工作还需进一步探讨。但建立多基因寡核苷酸芯片系统对研究胰腺癌及胰腺良性疾病的基因改变、探讨基因突变和缺失与胰腺病变生物学特性相关性有重要意义。【提供服务：生物芯片整体解决方案、兽药残留芯片检测系统；生物芯片扫描仪等仪器；耳聋基因芯片、乙肝病毒耐药检测芯片、抗核抗体检测蛋白质芯片、结核分枝杆菌耐药检测芯片、G+细菌鉴定与耐药检测基因芯片等；食源性致病微生物检测试剂盒、兽药残留芯片检测试剂盒等；HLA基因分型检测方案、血小板基因分型；人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、家蚕全基因组寡核苷酸微阵列芯片服务、人肿瘤相关基因寡核苷酸微阵列芯片服务、miRNA微阵列芯片服务、DNA甲基化谱检测寡核苷酸芯片服务等；合作共建研究中心服务、生物芯片实验室建设服务、科研课题研究服务；糖尿病超强化治疗技术应用项目合作。请联系索取详细产品和服务介绍资料：医学与生命科学服务中心暨虫洞（北京）卫生科技有限公司，戴天岩  主任、总经理，手机：13051069337，E-mail:davad311@126.com，msn:davad311@hotmail.com,qq:104974415，虫洞医学与生命科学网http://blog.sina.com.cn/cnyr】

【参考文献】
  　　1 Hayashi N，Egami H，Ogawa MGenetics of pancreatic cancer：recent advances in molecular diagnosis〔J〕Nippon Geka Gakkai Zasshi,2002；103:47681

　　2 Jemal A，Murray T,Ward E,et alCancer statistics，2005〔J〕CA Cancer J Clin,2005；55:1030

　　3 Otsuka M，Hoshida Y，Kato N,et alLive chip and gene shaving〔J〕J Gastroenterol，2003;38:8992

　　4 Carulli JP，Artinger M，Swain PM,et alHigh throughput analysis of differential gene expression〔J〕J Cell Biochem,1998;30/31(Suppl):28696

　　5 Schmied BM，Ulrich A，Matsuzaki H,et alIn vitro pancreatic carcinogenesis〔J〕Ann Oncol,1999;10:415

　　6 Pavelic K，Hrascan R，Kapitanovic S,et alMolecular genetics of malignant insulinoma〔J〕Anticancer Res,1996；16:170717

　　7 Bartsch D，Hahn SA，Danichevski KD,et alMutations of the DPC4/Smad4 gene in neuroendocrine pancreatic tumors〔J〕Oncogene,1999;18：236771

　　8 Moore PS，Zamboni G，Brighenti A,et alMolecular characterization of pancreatic serous microcystic adenomas：evidence for a tumor suppressor gene on chromosome 10q〔J〕Am J Pathol,2001;158:31721

　　9 Kubrusly MS，Matheucci Junior E，Leite KR,et alDetection of codon 12 mutation in the Kras oncogene in pancreatic tumors〔J〕Rev Hosp Clin Fac Med Sao Paulo，1999；54:1720

　　10 Ishikawa T，Nakao A，Nomoto S,et alImmunohistochemical and molecular biological studies of serous cystadenoma of the pancreas〔J〕Pancreas,1998;16:404