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视频：第一、二、三代测序方式的原理

(2014-01-02 21:03:24)
标签：

ngs

测序原理视频

sequencing

genome

nanopore
第一、二、三代测序原理视频
目录：

第三代测序：
  • nanopore
  • PacBio
  • Helicos

第二代测序：

  • Illumina
  • Ion Torrent
  • Roche 454
  • SOLID
  • Complete Genomics

第一代测序
  • Sanger
  • PyroSequencing

第三代测序

  • NanoPore的测序原理：

    1. 蛋白质小孔嵌在人造膜上型成纳米级（nm）的小孔

    2. 膜两侧有电压，电流通过这个小孔

    3. 当单链核酸通过这个小孔时，对电流型成一定的阻止作用

    4. 4种碱基对电流的阻止强度不一样

    5. 通过检测电流大小的改变，来判断通过的是什么碱基

    6. 最后得到DNA序列


  • Pacific Bio的测序原理：

  • Pacific Bio 测序原理：

    1. 用4种荧光分别标记4种dNTP

    2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物

    3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部

    4. 让DNA链与酶结合，进行测序

    5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合

    6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到

    7. 酶反应过程，一方面使链延伸，另一方面使dNTP上的荧光基团脱落

    8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行

       

  • Helicos 测序原理

    1. 单个DNA链杂交到测序芯片上

    2. 4色荧光标记的可逆终止dNTP混合物与模板在聚合酶的作用下进行聚合反应

    3. 洗掉没有结合的荧光dNTP后，激光扫描拍照

    4. 根据所发出的荧光判断DNA序列

    5. 荧光基团、终止基因被分解掉，延伸链得以继续下一个循环的延伸

     

    Helicos公司现已倒闭。但是我们还是可以从中学到许多知识：

    1. 单分子的荧光信号太弱，不能很准确地进行碱基判读，这导致碱基信息的准确性下降。相对应的，是Illumina通过桥式PCR把模板数扩增到上千个，大大增强了荧光信号，并增加了碱基判读的可靠性

    2. 模板链是通过杂交连到测序芯片上的，而不是通过共价键连到芯片上的，这导致多轮的液体冲洗后，许多模板链被洗掉；而且又是单分子测序，没有其它的同源分子可以弥补，所以有效读长不够长。

     



第二代测序

  • Illumina测序的原理：

    1. 鸟枪法建库

    2. 桥式PCR把单个DNA模板在测序芯片上放大到成簇的几千个拷贝

    3. 可逆终止法+四色荧光标记物的边合成边测序

    4. 激光扫描，荧光成像

    5. 根据光点的颜色、和空间位置，判读DNA序列

 

  •   Ion Torrent 测序原理：

  1. 鸟枪法建库

  2. 基于油包水PCR的微珠模板扩增

  3. 微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片

  4. 在测序芯片表面，分次分别流过４种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应。每次发生聚合反应，释放出H+离子，微珠周围微环境中的PH值发生改变。

  5. 微电极检测PH值的改变，转换成相应的碱基信号，最后得到DNA序列


 

  • Roche 454 的测序原理：

  1. 鸟枪法建库

  2. 基于油包水PCR的微珠模板扩增

  3. 微珠加上测序引物和聚合酶后，被加裁到有PH微传感器的测序芯片

  4. 在测序芯片表面，分次分别流过４种dNTP，微珠表面的核酸进行边合成边测序的反应。每次发生聚合反应，释放出焦磷酸

  5. 焦磷酸被焦磷酸酶水解，释放出光子

  6. 光通过光纤被传递到光探头

  7. 光信号被转换成碱基信息，得到DNA序列



  • SoLID测序原理
  1. 鸟枪法建库
  2. 油包水PCR，得到长了DNA片段的珠子
  3. 珠子放到测序芯片上
  4. 加入4种荧光色的寡聚物探针进行杂交，探针上有2个位置的碱基是特定的，别的位置是简并的碱基
  5. 加入连接本酶，把能够杂上的寡聚物连到测序引物上
  6. 洗掉过量的探针
  7. 激光扫描看荧光
  8. 重复4~7步骤，得到延长36~50个碱基的长度
  9. 洗掉第一次的测序延长链
  10. 错位加入荧光探针，重复4~8的过程
  11. 把错位的荧光信号排列组合，得到DNA序列
动画的链接（没法直接在本博客中显示，只能大家自己点链接去看）：http://www.dnatube.com/video/27908/Solid-DNA-sequencing-animation

原理图：


  • Complete Genomics (CG) 测序原理（抱歉，没有动画，只能用图来说明了）



第一代测序
  • Sanger 法测序原理
  1. 用带四色荧光的ddNTP和正常dNTP的混合物与测序模板进行反应，得到不同长度的片段
  2. 每种碱基，都在相应的长度上有一部分的带荧光的片段
  3. 用毛细管电泳进行电泳
  4. 用激光来测泳出的片段的先后、和相应的荧光颜色
  5. 根据荧光的颜色，来判断碱基；用泳出的时间来判断片段的长度



  • PyroSequencing 测序原理
  1. 每个dNTP被聚合酶加到DNA链上时，都会放一个焦磷酸分子

  1. 焦磷酸可以被焦磷酸酶降解成一个ATP和一个AMP

  2. 荧火虫酶能够把ATP再水解，同时发出一个荧光光子

  3. 测序时，把4个dNTP轮番加入反应体系中，通过对所放出的荧光强度的检测，判断所测的DNA序列



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