1.    根据对于单个样本所需检测的基因范围分三档

a.    测序范围 <= 100Kb，推荐用Sanger法测序

b.    500Kb <= 测序范围 < 100Kb，推荐用扩增子法测序

c.    200Kb < 测序范围 <= 100Mb，推荐用目标区域捕获测序

 

 

2.    根据上面的分法，经济比较

a.    Sanger法测序，适用范围：测序范围长度 <= 100Kb

                                  i.    用传统sanger法测序，

1.    每500bp测一对来回，每个测序20元（PCR + sanger测序）。

2.    每个样本的测序成本：100000/500 * 20 = 4000元/样本。

3.    数据分析，500元/样本

4.    再加一点人工，总成本4500元/样本以内就完成了。是优势选择。

                                ii.    用高通量测序，建库2000元/样本，再加测序的上机费1000~3000元/样本，还有二代测序必须的生物信息分析费，成本上不占优势。高通量测序在此的唯一的优势，是可以在一个试管中完成PCR，减少起始样本（DNA）用量

 

b.    扩增子 + 二代测序，适用范围：500Kb <= 测序范围长度 < 100Kb

                                  i.    用扩增子（Amplicon）法测序

1.    以200Kb，100样本为例

2.    引物及PCR，设计多重PCR引物，每个扩增子约150Bp的长度，总120000元，分摊到每样本，1200元

3.    PCR反应，成本 20元/样本

4.    建库，2000元/样本

5.    测序，

a.    Miseq平台，5G数据/run，26500元/run

b.    如果一次跑一个run，测24个样本，每个样本的测序部分的成本：26500/24=1104元/样本

c.    如果一次跑超过24个样本，测序成本可以进一步分摊

6.    数据分析， 500元/样本

7.    总成本： 1200 + 20 + 2000 + 1104 + 500 = 4824元

                                ii.    数据的覆盖深度：

1.    Miseq平台，

a.    PE 2*250 测序模式

b.    总共5G数据/Flowcell，

c.    分到24个样本，最多可到96个样本

d.    被测范围， 200Kb

e.    覆盖深度，5,000,000,000/24/200,000 = 1041倍覆盖；如果是96个样本，5,000,000,000/96/200,000 = 260倍

2.    PGM平台

a.    314芯片（也可以选用316/318等芯片，只有通量差别，没有质量差别）

b.    分到4个样本

c.    每个314芯片的数据产量0.1G

d.    被测范围200Kb

e.    覆盖深度，100,000,000/4/200,000=125倍

                               iii.    扩增子测序是100Kb~500Kb测序长度范围内的优势选择

                               iv.    用sanger法测序，200000 / 500 * 2 *30=24000，成本过高，不可行

                                v.    用捕获测序，约5000~6000元，较贵，且操作复杂，分析也复杂，

                               vi.    扩增子测序的限制因素：扩增子测序前一步要做多重PCR，到目前为止，多重PCR扩增效率的一致性一直是大难题。扩增子越多，不均一性越高。这使用大于500Kb的范围的测序，很难用扩增子测序的方法做好。

 

c.    目标区域捕获法测序，适用范围：100Kb < 测序范围 <= 100Mb

                                  i.    用捕获法测序

1.    采购捕获试剂盒，

a.    Nimblegen的SeqCap EZ Choice Library, 96 Reaction，USD30000

b.    折合含25%税的每反应人民价格：30000*6.2*1.25/96=2421元/反应

2.    建库，捕获反应

a.    建库， 2000元/样本

b.    捕获操作， 3000元/样本

3.    测序，Hiseq 2500 Rapid PE150测序（临床样本追求速度，Rapid快，只用2天测序，比Hiseq 2000 high throughput PE100 的11天更合适），

a.    每个Flowcell, 75G PF data

b.    一次每个样本测2G PF data

c.    一个Flowcell，24个样本，因为样本之间在测序过程中的相互竞争，所以上样按每个样本3G上样，这样可以保证大部的样本可以得到2G以上的数据。24*3=72G

d.    测序深度，假设捕获区间为7M，捕获的效率为65%（有35%为非特异的片段），2,000,000,000 * 0.65 / 7,000,000 = 185倍，符合绝大多数的检测需求

e.    测序成本，每个Hiseq 2500 rapid PE100 flowcell，8万元，分摊到24个样本，80000/24=3333元/样本

4.    数据分析

a.    假设：2000元/样本

5.    总成本

a.    总成本：捕获试剂 + 建库 + 捕获操作 + 测序 + 数据分析 = 2421 + 2000 + 3000 + 3333 + 2000 = 12754元/样本

                                ii.    捕获测序是优势选择

                               iii.    扩增子测序，因为其测序所需的多重PCR的中的扩增子过多，所以不可行。并且Miseq或PGM的数据产量也不能很好地覆盖被测样本。

 

 

3.    所用时间比较

a.    sanger法，如果同步进行，10Kb以内的范围，可以在1~2天内完成

b.    扩增子法，PCR用0.5天，建库2~3天，测序1~2天，数据分析2~3天，最快1周出结果

c.    捕获法，建库2~3天，捕获2~3天（杂交反应，必须慢，没法更快），测序2~3天，数据分析2~10天，最快10天出结果