Introduction to Protein 2D IR Spectroscopy

Carlos R. Baiz, Mike Reppert, Andrei Tokmakoff

MIT, June 1, 2012

1. 概述

    所有的蛋白质的生物功能涉及构象变化，如酶的催化，输运，信号传递，动力学折叠，电荷传递，力学或电子能量传递。二位红外光谱提供了观测皮秒到毫秒时间尺度的构象动力学和构象变化。而且也可用于研究蛋白质聚集和淀粉样纤维，无序多肽和膜蛋白。

    二维红外光谱是作为研究溶液中的瞬时分子结构和动力学的工具而发展的。作为振动光谱，它直接反映化学键的振动，以及分子内多种振动模式之间、分子与环境的振动模式之间的相互作用。在二维核磁共振谱的启发下，二维红外将振动光谱在两根频率轴上展开，显示特定频率的振动激发，在一个waiting time之后，如何影响所有其它振动。光谱特征，包括频率，幅度，峰形，和这些特征随时间的演化，被用于理解空间和时间上的结构连通性。如果能够获得关于振动相互作用机理的足够多的信息，我们就能解释振动背后的结构信息。

    从水在亚皮秒尺度上的波动，到小时级别的聚集过程，生物物理过程跨越多个时间尺度。图1显示不同的过程及其相应的时间尺度。二维红外的测量是在皮秒或者更快的快门速度下进行的，它捕捉溶液中与大多数动力学过程相比更快的时间尺度上的分子结构信息。相关二维红外，其中的waiting time是变化的，在皮秒尺度上表征动力学。二维红外的非平衡变种，比如温度跃变(Temperature-jump)的二维红外，把二维红外光谱技术考察的动力学范围从皮秒扩大到了毫秒，并得以研究蛋白折叠和集聚(association)的过程。更长的时间尺度可用快速连续扫描二维红外的方法(rapid-acquisition continuous-scanning 2D IR methods)。

    对实验目标的细致分析有利于二维红外实验的设计。例如，短程结构和动力学比如氢键环境可采用二维峰形分析，或针对局域化振动(localized vibrations)的waiting time动力学实验，反之，离域化的amide I光谱给出蛋白质结构的全局信息。触发实验(Triggered experiments)用于研究非平衡构象动力学。最后，实验光谱的解释可施于多个层次：经验规则提供基本结构信息，而更复杂的结构图像则涉及光谱模拟。类似于核磁共振NMR光谱，二维红外为基于结构模拟方法提供一系列结构约束，以便这些模拟能够找到与实验约束一致的结构。有一种称为半经验静电图的描述二维红外光谱的方法，可描述蛋白中与结构相关的振动耦合和频率位移。这些技术可与分子动力学或者Markov State Modeling，或其它基于结构的计算生物物理模型模拟结合。

        本章向希望使用该技术研究蛋白质结构和动力学的新手提供一个概述。第二部分和第三部分介绍二维红外的方法、理论和它在研究蛋白质结构，蛋白质溶剂化，折叠，结合，和蛋白-蛋白作用中的应用。迄今为止，二维红外光谱主要集中研究amide I 振动，此振动主要由C=O伸缩和N-H摇摆振动构成。由于在整个蛋白骨架上离域，amide I 模式对于蛋白质的全局结构非常敏感。不过，也有许多其它的振动探测，研究的是局部结构，溶剂暴露，和氢键。不同振动模式之间的交叉相关可将单一振动模式所包含的信息联系起来，以研究从单个振动中不可能获得的结构信息。第三部分探讨局域化振动探测的好处和其它骨架振动模式。第四部分模拟蛋白质二维红外的框架和分析方法，面向理论和分子动力学模拟研究者。

2. 背景

Amide I modes

Amide I，   1600-1700 cm-1，C=O伸缩/N-H摇摆， 提供多肽和蛋白质二级结构和氢键的确切光谱指纹

不同肽单元上amide I振动之间的相互作用或者耦合是蛋白质骨架离域化振动的原因

除脯氨酸Proline外，侧链振动与amide I 振动间的作用很弱;

局部Amide I模式（或位点）：单个肽单元上的振动

离域化振动：简谐体系中的正则模式，或更一般地称为激发子。正则模式的特征由蛋白质骨架的对称性支配

宽的吸收峰和大量离域模式的存在模糊了amide I谱中的信息。二维红外通过将光谱信息在2个频率轴上展开并计算不同振动之间频率相关性而获取结构信息。

Amide I 红外光谱的结构解释

经验关系：α-helix螺旋 1650附近的单峰；β-sheet片层在1630和1680附近存在2个峰，其中心频率和强度依赖于β strands 的长度和数量；无序结构区域的振动也在1650附近一个很宽的单峰

图2：肌血球素Myoglobin (α-helix), 泛素Ubiquitin(mixed α/β), 伴刀豆蛋白Concanavalin A(antiparallel β-sheet

二维谱可解释为联系一系列激发频率(ω1) 和一系列检测频率(ω3)的二维地图。对角轴表示激发和检测到的频率相同，近似对应于吸收光谱。非对角线上的峰表示激发了某个频率的峰，却检测到了一个不同的发射频率，反映了不同模式间的耦合或者能量传递。作为振动非谐性的结果，谱上每个峰显示为一个“正/负”对。

Myoglobin (α-helix)在1650附近有一个峰（I）。

Concanavalin A(antiparallel β-sheet)在1620和1670附近分别有2个峰（I、II）两个峰都很宽，所以光谱沿对角方向伸长。非对角线上的两个窄峰（I-II和II-I）说明在宽的对角峰的掩盖下存在两个截然不同的跃迁。

Ubiquitin(mixed α/β)，来自α-helix和β-sheet残基的贡献显示为1640附近的一个特征峰，并向低频I区和高频III区有个很强的对角延伸。在[1640, 1680]附近可看到交叉峰( I-III 和 III-I )，这是β-sheet的清晰特征。此类mixed α/β蛋白很象是纯的α-helix和β-sheet的峰的组合。

α-helices： 模拟发现理想α-helices螺旋有2个主要的红外活性模式，分别有A和E1对称，其中A模式占70%强度， E1模式存在一个大约3.6残基每周期的周期性相位移。A模式随长度增加而红移，从5-10残基的1660到超过20个残基的1650。而E1模式的频率却没有对长度的依赖性。A-E1频率分裂和E1相twist归因于较大的相邻肽单元之间的正耦合，和氢键之间的负耦合。由于A模式引起α-helices中的主要强度，因此对于以α-helices为主的蛋白质可以观察到随螺旋长度而变化的频率。然而这个10cm-1的位移相比于Amide I的～60cm-1的总宽度太小了。极性调节的二维红外实验能够在实验上对21-残基长的螺旋多肽解析这2种模式，发现E1和A模式分别以1638和1650为中心。

3-10 螺旋： 3-10非常类似于α-helices：低频Ａ模式和高频Ｅ模式存在10-15的分裂，且随螺旋长度变化而变化。振动圆二色谱和FTIR，以及计算研究显示3-10螺旋比α-helices的峰要红移5-10cm-1。由于峰形宽，通过红外吸收光谱区分二者比较困难，单最近的研究显示amide I的二维红外包含了能够区别于α-helices的3-10螺旋的光谱指纹。

β-sheet：反平行β-sheet由重复的呈矩形的4肽单元构成。对于理想的无限长β-sheet，单个单元的振动即可描述观察到的片层振动。一个包含4个振子反平行片层的单胞可观察到4个不同模式。最低频红外活性模式，承载大部分强度，显示为一个1630-1640附近的窄带，并涉及相邻β股链上位点的同相振动。在此4肽单元中，此模式涉及沿矩形对角线上相对角上单元的同相振动，用υ⊥表示，因为跃迁偶极矩与β股链垂直。高频红外活性模式，υ // 表示，以1670为中心，有整体上强度较低，因为它涉及沿同一β股链上相邻残基的同步振动，以及在相邻股链间氢键结合的邻近残基间不同步振动。图4显示理想反平行β-sheet 的模拟光谱。随着片层长度增加，υ⊥红移～20cm-1, 且强度相对于υ // 增加。高频υ // 峰位几乎不变，所以被看成是β-sheet 结构的内部参考指示。这样，β-sheet中υ⊥的红移就被看成是是β-sheet长度的指示。

平行β-sheet 可由一系列重复的双残基单胞描述。因此，其无限长平行β-sheet的振动光谱将显示2个主要的振动峰。在一个4x4残基的理想片层中，1660附近参出现高频峰，单几乎没有什么强度。振动子的大多强度红移到了低频峰上，在1635附近，被认为是同股链上的残基的不同步振动。

β-turn转角： 实验上很难将β-turn构象的贡献区别开来。因此其指认主要是通过模拟推测的。大致来说，β-turn的峰出现在1680附近。由于β-sheets的υ // 也出现在这一区域，并且两峰强度都被认为很弱，所以1680易被错误指认。所以，对β-turn的指认要特别小心；

Coils无规卷曲：无结构的卷曲在1650-1660附近呈现一个宽的，无特征的峰。由于缺少长程序，卷曲呈现随机耦合模式，可能导致展宽的峰。并且，骨架更容易接触溶剂，导致频位增加，峰进一步加宽。区别α-helices和随机卷曲的困难是amide I红外吸收光谱的缺点。由于随机卷曲有更多的溶剂接触，H/D交换实验和waiting-time实验，结合同位素标定可以帮助指认二级结构。

Doorway Mode Analysis：对蛋白质单个amide I 各模式的直观解释非常困难，一是因为有大量的模式挤在这么小的一段红外区域，且模式间有部分混合特征，单个的振动模式经常在α-helices和β-sheets上离域。第二是因为正则模式的特征是高度动态的，结构和溶剂环境的微小改变可能导致模式的重新组合。所以，尽管正则模式图像提供了描述模型的便利框架，但是单个正则模式对解释光谱的帮助很小。由于同一频域内的正则模式有相似的整体特征，所以可采用doorway mode analysis而不是聚焦于单个模式。简单说，doorway mode analysis依靠奇异值分解(singular value decomposition)，对在一个小的频域窗口内的一系列正则模式投射出相同的振动特征。强度加权的组成称为doorway modes，提供了在特定频域内正则模式的特征的直观图像。主要组成模式的特征较少收到结构变化的影响，所以允许同一蛋白不同构象的模式比较，甚至是不同蛋白。

图5显示4个蛋白的模拟光谱，有不同α-helix/β-sheet构象：从50% β-sheet（Concanavalin A）到75% α-helix（Myoglobin）。为了解释amide I 光谱指纹，每个残基都被指定为如下4中结构之一：α-helix， β-sheet， β-turn和无规卷曲coil。doorway state的结构特征可由每个振子对单个二级结构的振幅的加权贡献计算。例如，一个β-sheet的doorway mode会有对此模式有贡献的大量β-sheet构象中的残基。图5中Doorway mode analysis显示对1630之下和1670之上的区域主要有β-sheets贡献。而amide I峰的中间主要由α-helix贡献。随机卷曲也对1650-1670之间的区域有贡献。这些观测与图3中的光谱指认一致。

二级结构之外：前述基本例子不足以解释所有二维红外中观察到的特征，说明光谱包含更多的与蛋白质的具体结构有关的细节信息。例如，有相似α-helix/β-sheet残基比例的蛋白的二维红外光谱却呈现非常不同的特征，说明蛋白质的三维结构特征包含在光谱中。迄今，超二级模式的光谱指纹仍然大部分未被研究。但是，我们需要更进一步的研究以理解以下问题：扭曲的β-sheet与平坦的理想的β-sheet的光谱有何不同？真实体系中相互接触的平行与反平行β-sheet如何区分？在有多个明确的二级结构中，比如一个卷曲的coil或一个蛋白质多聚体中，有不同的分子间耦合吗？这些是活跃的研究领域。

淀粉样蛋白amyloid和聚集  误折叠的蛋白质，比如广泛研究的β-amyloid多肽，聚集成不溶纤维，有明确定义的堆积的平行的cross-β-sheet结构。有限数量但高度有序的插入到纤维中的水对一个尖的β-sheet峰有贡献。淀粉样聚集的动力学可由红外光谱便利地观测，聚集激励的分子细节可由同位素实验帮助理解。其它不溶蛋白聚集显示1620附近的一个单个峰。窄的峰形和频率红移使得红外光谱对样品中的聚集尤其敏感。非线性方法进一步增强了光谱特征，比如，即使样品中只有少量聚集，也会产生强烈的特征支配amide I光谱。

图6, 胰岛素insulin的光谱描述了多维光谱如何灵敏探测导致蛋白质二聚，多聚和聚集的接触和作用。与单体光谱相比，二聚体光谱线了与β-sheet相关的特征：一个双峰结构和一个更明显的β-ridge，说明了两蛋白质单体间的β-sheet，并说明界面残基保持了无序构象。聚集体和纤维样品显示了双峰模式，但是有不同的中心频率和峰的强度比例，说明聚集体有较大比例的残基在α-helix或无序构象区，而在纤维中，主要特征是有序β-sheet。对这些数据的简单说明虽然是定性的，但是能够帮助我们表征与蛋白质结合和纤维形成有关的结构变化。最近关于淀粉样多肽的研究显示了定量的模拟，结合同位素标定，如何为深入理解蛋白质聚集和纤维形成的机理提供细节。

光谱上隔离的位点：氢键和同位素标定

氢键    氢键稳定蛋白质结构。红外光谱是少数对氢键作用敏感的光谱：amide I 振动频率位移取决于氢键的数量。氨基氧原子与水分子的单个氢键会使amide I 频率红移大概16cm-1. 氧原子能够接受多个氢键的能力导致暴露于溶剂的残基有强烈红移的跃迁。理解氢键导致的位移是直接的。振动频率正比于键伸缩常数的平方根，反比于振动子的约化质量。从化学键的观点来看，氢键减小了π轨道的重叠，CO形成的部分单键C-O-H特征，C=O...H双键。类似地，氢原子可看作有效增加了氧原子沿C=O双键的约化质量，从而降低振动频率。这个氢键强度和振动频率的关系已对多个体系进行了测量。一般来说，观测到的振动频率位移正比于氢键的强度。氢键距离r_OH与C=O频率位移δV之间的经验关系，对于水中的二肽为：δV=30*（r_OH - 2.6）其中r_OH是C=O中的氧原子与水的氢原子之间的距离(in Angstrom)。

同位素标定  振动光谱的一个独特的优势是能够对单个残基和小的区域以无损伤同位素标定方法进行光谱分离。单个13C同位素标定可对局部振动红移35-40cm-1, 并将其从与其它残基的耦合中分解开。但由于amide I的峰宽为80-100cm-1，尚不足以完全隔离单个残基，不过一个18O标定可提供额外所需的25-35cm-1的红移。

图7提供了一个一个12残基的β-hairpin发夹多肽TrpZip2的二维红外光谱，K8位的一个同位素标定揭示了构象不均匀性。K8标定后出现了两个间隔一个氢键(16cm-1)的双峰，这个裂分是由于不同的β-turn构象：K8-1对应一个外凸的圈形构象，其中对溶剂暴露的羰基C=O平均接受2个氢键；而K8-2是属于type-I’类型的，有一个K8-W4内氢键。这个指认是通过分子模拟得出的。这些细小的结构差别反映了振动光谱的精细的结构分辨能力。构象动力学能够从二维峰形中获取，对角方向的峰宽与构象无序度有关，反对角方向则描述分子在该状态采样的时间尺度。K8-2对角峰形宽，说明相对于更加刚硬的K8-W4氢键，暴露于溶剂中的构象的无序度增加。根据预测这两个β-turn构象在毫秒时间尺度内会互相转化。这个例子强调了非线性红外光谱在结构和超快时间分辨能力。

探测蛋白质结构的其它模式：Amide II和侧链振动 （1400-1800 cm-1）

Amide II   Amide II模式的特征是大幅度C-N键伸缩与N-H弯曲运动的耦合。鉴于H原子的剧烈运动，氘化后可导致此模式从～1550 (Amide II) 红移到～1450(Amide II')。与amide I比，它也包括一些N-H弯曲运动，但氘化后仅红移～10 cm-1. H/D交换率与溶剂暴露和蛋白质构象柔韧度有关。amide II 对 amide II‘ 的吸收强度比率正比于质子化残基与氘化残基的比例。不过，Amide II被认为对结构更不敏感。此外，很多侧链吸收与amide II重叠。所以，迄今，很少实验和理论工作区直接研究admie II模式的结构敏感度。第5部分描述了最近一个二维红外光谱研究，结合amide I和II，使得能够直接测量蛋白质中单个二级机构的溶剂暴露程度。

其它amide模式  除了Amide I和II，与氨基相关的骨架振动还有很多：amide III（1200-1400），C-C和C-N键联合同步振动，并包含C=O面内弯曲模式的贡献。Amide IV（～630）主要是C=O面内弯曲和一些来自于C-C伸缩和CCN扭曲的贡献。Amide A（～3170）和amide B（～3300）模式主要是N-H伸缩。由于不同的原因，这些模式尚未在蛋白质结构的光谱研究中引起注意。

侧链吸收    在amide I附近，连接羰基的侧链，芳香还，或者guanidinium胍基均有吸收，包括arginine, asparagine, aspartic acid, glutamic acid, glutamine, tyrosine, and tryptophan。侧链振动提供了研究蛋白质结构的有用帮助：羧酸对金属配合和质子化状态敏感，并由此对pH和溶剂暴露敏感。一些模式，特别是那些涉及氢原子大幅运动也对氘化敏感，这样，这些频率揭示了H/D交换实验中的溶剂暴露程度。作为对比，芳香环模式的特征是带宽窄，中心频率对环境不敏感。非共价作用比如静电作用，或非极性芳香作用，对于稳定蛋白质作用非常关键，也提供了驱动蛋白质识别、结合的表面接触。结合口袋内的侧链决定底物选择性，并提供催化所需的基本作用。侧链光谱可能帮助理解结构，非均匀性，折叠，或催化机理，特别是结合amide I 和 amide II 光谱。超快红外源产生的宽带脉冲信号有利于在3-7um区域内测量骨架amide I/II和侧链瞬时振动（图9）。探测骨架和侧链动力学的不同可能对理解驱动蛋白质折叠中骨架和侧链排序非常有用

e.  振动检测和非天然氨基酸

最近，实验上的研究局部结构和动力学的策略涉及使用非天然侧链。（略）

3. 实验方法

一维和二维红外光谱    

红外吸收是电磁场和振动着的分子偶极矩之间相互作用引起的。经典图像中，若分子某一模式的振动与入射光频率相同则发生共振，此模式振幅加大。反过来，振荡的电荷会放出与入射光异相的电磁波，导致破坏性的干涉，产生观测到的吸收峰。大的原子电荷产生强的振荡偶极矩，反过来产生强的吸收峰。

一维红外    红外吸收光谱一般使用非相干光。如果使用短时脉冲的相干光，样品在红外脉冲穿过后会保持其极化，(oscillating polarization persists)，就象一个钟被锤子撞击后的持续鸣响。若要测量此极性所放射的场， 可使用一束在不同时间延迟(由迈克尔逊干涉仪的光程差)之后到达的脉冲与此极化相干涉。此时域振荡信号经傅立叶变换可得到二维吸收光谱。这种使用由干涉仪产生的成对电场以测量吸收光谱的方法即为傅立叶变换光谱。此光谱与频域实验得到的光谱是一致的。频域实验测的是特定频率单色光穿透样品前后的强度变化。他们都是一维实验，因为只有一个独立的时间或频率变量。

二维红外     在二维光谱中，我们测量的是在一个独立频率激发后整个吸收光谱的变化。也可以进行频域上的双共振实验，使用独立的激发波和检测波。傅立叶变换方法仍然是这里最通用的的方法。初始短时脉冲激发之后，后续的脉冲波可与样品极性相互作用以产生非线性极化。由于多个脉冲可以激发或者解激发(de-excite)样品多次，最终的非线性极化放射出的光包含了线性光谱中没有包含的关于分子势能的频率信息。

图9显示了二维红外光谱中所用的脉冲序列。通过在每个时滞τ1之后，将放射信号与一束干涉光重叠，可记录一个干涉图，即可从光谱干涉仪中获得放射信号的幅度和相位。放射信号的频率组成直接在光谱上的检测轴上表示，第1和第2两脉冲之间的时域τ1上的信号的傅立叶变换生成激发频率(ω1)。第2和第3脉冲之间时间延迟τ2被称为等待时间waiting time或分布时间population time，对应于激发和检测事件之间的时间。激发和检测的时间常被称为相干时间(coherence time)，因为被测量信号包含了此时间周期内不同状态的相干重叠。

二维红外光谱能够测量的振动模式由载频carrier frequency，持续时间duration，和实验所用飞秒红外脉冲的带宽bandwidth决定。当前商业激光源一般是3-8um（3600-1200cm-1）脉冲长度在50-100飞秒之间，对应带宽50-100cm-1. 为描述这些光源的能力和局限性，图8显示了Ubiquitin和NMA红外吸收光谱，以及典型OPA源的光谱。新的基于等离子体的宽带红外（BBIR）可产生覆盖整个振动光谱直至4000cm-1的红外脉冲。当前，脉冲能过低妨碍了它们作为红外激发光源的使用，但是提供了一条同时探测多个跃迁的新道路。

二维红外光谱是样品复杂三级红外响应的最完备的表示。响应函数的一维投影可以以DPP(dispersive pump-probe)， DVE(dispersed vibrational echo)， HDVE(heterodyne-detected vibrational echo)信号的形式测量。这些信号包含二维红外光谱的大多数信息，并能投影到单个频率轴上。这比完全二维红外光谱快多了。所以，一些实验比如下面描述的温度跃变(T-jump)实验，使用DPP， HDVE探测动力学变化，而二维红外光谱仅在特定时滞上测取以获得瞬时响应的结构图像。二维光谱是复数量，包括吸收性absorptive和色散性dispersive特征。然而，只给出光谱吸收部分的做法很普遍。色散性的激发-探测(pump-probe)实验，光谱为吸收性的，对应二维红外光谱在图10上ω3检测轴上的投影的实部。复数HDVE谱对应于二维红外光谱在检测轴上投影，尽管一般只画出其实部，等效与DPP谱。

除了激发和检测频率，另外一个重要的光谱变量是四个红外信号的极性polarization，它是指在空间中传播的脉冲静电场的向量的方向，而不是上述样品中一个个振动偶极矩的方向。在特殊的极性产生条件下，我们可以控制四个激发和检测场的极性，用于决定分子内不同跃迁的方向，提供额外的结构信息。两个主要的偏振条件为平行ZZZZ（四个极化的脉冲互相平行）和垂直ZZYY（前两对垂直与后面两个）。平行和垂直极性产生条件分别增强了相对于跃迁偶极矩方向平行或者垂直方向上振动间的交叉峰。两个跃迁偶极矩的角度可以直接从不同极性产生条件下的峰的强度推算出来。

为描述二维红外光谱包含的信息，图11显示了一个模型化合物RDC在正己烷中羰基振动的二维红外光谱。羰基两种伸缩，对称和不对称，产生的尖峰是二维红外光谱中的典型峰带模式。最上面的是吸收光谱，在2014和2084产生2个尖峰，分别对应对称和不对称伸缩振动。在本文语境下，需要澄清“局部模式”(local mode)，“正则模式”(normal mode)和“本征状态”(eigenstate)三个术语的区别：局部模式，典型的是与单键振动有关，更重要的是它们构成正则模式的基础；在RDC中，两个局部模式对应于每个端基C≡O键的伸缩。在蛋白质中中，我们所用的amide I局部模式基础对应于每个肽基的C=O伸缩和N-H弯曲振动。局部模式常又称做振动子oscillators或者位点sites。正则模式涉及局部模式的线性组合，每个位点的同相或异相振动子给出每个正则模式以独特的特征，而且，由于这两种表示是线性变换的关系，所以正则模式的数量等于局部模式的数量。在RDC的例子中，两种正则模式分别对应于C≡O振子的同相和异相振动：对称和不对称伸缩。最后，本征态表示的是从振动系统的哈密顿中推导出来的一系列完全正交非谐振动，并常被称为可扰动的正则模式的混合物(perturbative mixtures of the normal modes)。例如，对称和非对称伸缩之间的对称、非对称，和组合态皆为本征态。在正则模式表示下，本征态由每个正则模式量子的数目表示。例如，单重和双重激发的对称伸缩表示为|s>和|2s>，其组合态表示为|as>。在非线性光谱中区别正则模式和本征态很重要，其区别起源于我们希望测量的振动的耦合，也因为光谱是对不同本征态敏感，而不是正则模式间跃迁的频率差别和偶极幅度。

二维红外光谱能够用一个二维地图解释，横坐标为激发频率(ω1)，纵坐标为检测频率(ω3)，见图11, 对角线上的峰对应于激发和检测频率一致的情形。在对角线下面的峰(3和3')对应于激发 |0> → |1>  ( |0> → |s>, |0>→|a>) 的跃迁，以及进一步的激发 |1>→|2>  (|s>→|2s>或者|a>→|2a>) 的跃迁。交叉峰代表 |0> →|s> 激发振动以及|a>→|0>的应激辐射(stimulated emission)。类似地，峰2'对应非对称伸缩的激发，峰4和4'来自于两个量子的组合态的跃迁。随后，峰5和5'来自于对称(非对称)伸缩 |0> →|s> (|0> →|a>) 的激发，和非对称 |2a>  → |a> (对称) 伸缩(|2s> →|s>) 的应激发射。分子的一个或两个量子能级能够从峰的位置简单地看出来。非谐性和耦合常数能够从光谱模拟中得到。交叉峰强度随激发和检测脉冲极性的变化可由两个振动的跃迁矩方向的相对角度确定。为描述此例，图11显示了计算的到的交叉峰的比率，使用三个不同极性几何(ZZYY/ZZZZ, ZYZY/ZZZZ)作为两耦合振子跃迁矩角度的函数。

结构信息从峰的位置和强度中获取，而动力学能够从峰形变化中获取，更具体地，峰的椭圆率，和椭圆率随waiting time的变化。图13显示一个例子，峰形随waiting time变化：在较早的waiting times，峰沿对角方向伸长，因为系综中的每个构象都有不同跃迁频率因而在激发和检测频率之间存在较大的相关。节点线(node lines)作为waiting time的函数而旋转，因为动力学效应引起相关的衰减。频率相关的消失，与样品中分子的频率波动直接关联，称为光谱扩散spectral diffusion。沿对角方向伸长称为非均性展宽(inhomogeneous broadening)。该例说明了锁定在刚性分子内的氢键构型中的残基的动力学比较缓慢，导致较小的频率波动，和一个较慢的节点线旋转，而暴露于溶剂的残基则快速地失去激发和检测之间的相关性。

瞬时温度跃变的二维红外光谱

等待时间二维红外提供亚皮秒时间分辨的结构信息，与此同时，另外一个被发展出来的强大工具将二维红外光谱和非平衡方法结合以研究较长时间尺度的蛋白质折叠、动力学和函数。因为红外光谱产生的是系综测量，这需要一个快速触发事件来同步系综的时间演化。激发(Pump)的时间分辨和探测(Probe)可及的时间尺度常常决定能够被研究的动力学类型。探测Probe的方法，比如二维红外，必须有很高的时间分辨率，很高的结构敏感性，但是更重要的是，反应坐标必须能够容易地映射到光谱坐标上。在蛋白质的研究中，同位素标定常作为选择一系列光谱变量的方法。

常见的触发包括以下几种：1电子激发(10-100fs)以探测超快激发态动力学和光致反应，或作为笼状化合物的光子释放的开关；2. 温度跃变(Temperature-jump)光谱(1-10ns)，研究热变性，蛋白质折叠，结合，非平衡动力学；3. 压力跃变(Pressure-jump)(1um)，研究压力导致的构象变化，比如部分变性；4. pH-jump方法(100us)以研究pH诱导的构象动力学或者不同蛋白位点的快速质子化；5. 截断流快速混合技术(1-3 ms)，探测蛋白质去折叠和变性或混合溶剂诱导的构象变化。其中，只有电子激发和温度跃变方法在超快二维红外光谱报道中介绍过。原则上前述任一技术都能与二维红外探测结合。然而，一个实施上的限制，在于生物样品观测到的非线性信号太弱，不可避免地导致较长的数据收集时间。所以，触发方法必须能够引起较强的信号变化，并和感兴趣的时间尺度相称。这里主要介绍由温度跃变触发的非平衡二维红外光谱技术。

图12是一个温度跃变之后样品的温度剖面的示意图。一个二维红外脉冲序列能够探测从纳秒到毫秒时间尺度上的结构重排。蛋白质动力学发生在不同的时间尺度上，但一般来说纳秒到毫秒的响应时间对应于重排能垒，而100us-1ms发生的跃迁归因于翻越能垒的事件。延迟时间(delay time) 是由温度跃变激光的重复率和样品驰豫限制的。在我们当前的实验中，最大延迟时间是50ms。

温度跃变脉冲必须携带足够的能量以升高溶剂的温度若干度。在我们的实验中，脉冲约为20μm，携带约20mJ的，频率20Hz。最短延迟由温度跃变脉冲宽度(10ns)决定，最长延迟由温度跃变激光器的重复率决定(50ms)。温度跃变脉冲与重水溶剂中的O-D伸缩的泛频共振。温度跃变后，溶剂随热从焦点区域扩散而返回平衡态。温度驰豫曲线为一拉长的指数曲线，时间常数约为3ms。为了获得焦点区的均匀加热，温度跃变脉冲对准样品中～1mm的点，且只有约10%的光被吸收了。产生了大概10度的温度跃升，导致amide I区的传播(transmission)变化了约5%。

试样制备（略）

同位素标定（略）