说在前面的话。

    我国生物技术工业化至今已有60多年的历史，现已有比较大的规模，也积累了不少的经验，无疑各方面的改进都收到了可喜的效益。在当下信息传播技术快速和广泛，使交流更容易。现所提交的是个人以前的一些工作认识，就算是交流交流。若能有一点益处，这是我的所求。

2012年5月20日 07:22:28

                    培养基制备的一些问题

                          李烈铭 （1991/8/15）

    培养基制备是微生物培养工作中一项重要组成部份，但凡接触过微生物培养的人都会了解。现在提出一些问题来讨论一下，可能会有一点益处。

    我们先研究一下培养基制备应达什么标准，或者一个制备培养基的工艺是优良的或者是不好的呢？按一般要求，培养基制备应实现三条：一是无杂菌；二是物料中的有效成分受到的破坏最少，或者产生对所培养的微生物有害的物质最少；三是其各物料的浓度符合所使用的配方。这三条我认为是衡量培养基制备得好或者不好的内容，也是评价工艺优劣的尺度。

    现就上述三方面内容回顾一下，实际上有哪些差距。

    实现无菌要求这一条，前人已做了大量工作，并已为人们普遍注意的事了，这里不再赘述。有一点要提出的是，其控制是受实现第二点的约束，具体又受采用何种工艺而有所变动。本人曾在摇瓶观察过以培养基的物理外观,作一个指标为准时，使用0.02MPa、0.05MPa、0.07MPa,三种消毒锅压力试验，结果是0.02MPa消后的料外观以及链霉素产生菌的前期生长情况，均优于0.05MPa和0.07Pa情况下的料，且与组合消(0.1MPa压力)的结果相当。可是0.02MPa消毒料，后来染杂菌了。

    第二条培养基的质量，现行的检定分析项目还难于明确判断，往往是经过生物培养后的结果来衡量，如对生物的繁殖快慢或者所需的产物多少等等为指标。关于提高培养基的内在质量的工作，已在一些微生物专著中以及一些有关微生物培养的研究报告中看到。如对配料中某些物料易发生反应，或被高温灭菌时破坏，常采用分开配制灭菌后合并，或者采用过滤除菌法后并合等等，对配制方法研究较早也较详细的可在《芽孢杆菌属》（美R.E.戈登等著蔡妙英翻译，农业出版社1983年11月出版）一书中看到，在那里提出了不同的配制方法，对所得的效果是不一样的。在方法上，研究了全料消毒法与分开配消法，过滤法等。在其它一些研究报告中也可看到，如吴瑞武等在研究红霉素发酵（《抗生素》5卷2期1980），虞悝在研究PYP-争光霉素发酵（《抗生素》6卷2期1981）。书籍方面可在《微生物保存法》（日根井外喜男编金连缘翻译，上海科技出版社1982年9月）；《植物病理学和真菌学技术汇编俞大绂编，人民教育出版社 1979年等等。这可见在研究如何提高培养基配制的质量方面是有不少人在研究，并且提出一些良好的方法。我们在50m³罐发酵链霉素生物合成的生产中，由于遇到蒸汽以及冷却水等供应不能正常保证时，使配制后的培养基物理外观有明显变化，主要是外观颜色变深，呈不同程度棕色，其影响表现在链霉素产生菌的生长繁殖受到了抑制，发酵水平也明显低，说明培养基质量下降。当时对配方内与可能在高温灭菌时发生料间反应的物料进行了试验观察，证实了存在。一旦分开配消时所组成的培养基，其外观得到了明显的改善。为此，在50m³罐上进行了试验，不改变原配方的情况下，利用现有装备，將物料分成三部份，(葡萄糖为一份；黄豆餠粉、碳酸钙为一份；其余的料为一份)，进行分别配制和消毒，待各个料温降低到接近培养温度后，进行并合成全培养基。第一批（SF601-49）在1983年4月14日进罐试验。结果很满意。后因设备不允许扩大试验，而改为使用陈四海高级工程师提出的‘水隔离法’（即消糖料外的其它料液后，接消一定量的水再消糖料）进行。企图不增加设备情况下，改善培养基质量的工作，结果仍受蒸汽和冷却水不能正常供应的影响，发酵水平仍有较大的波动。组合法一共试验4批，均有很大改善。基于这些事实，被迫化大的工作来确保蒸汽和冷却水的供应，才使生产恢复到较正常水平。见下表。 

l  发酵罐培养基消毒现行工艺为分开配制，连续消毒，分段控制消温法。

数据来自1983年4月至6月

    由于组合法带来培养基质量提高，收到较好的效果。在此后又进行了培养基的消毒强度不同时，对不同配制方法的实验研究。（《长药科技》1989总第二期《改进利福霉素培养基消毒工艺的摇瓶试验研究》）。结果说明组合法允许较强的消毒条件（时间、压力），仍能保持好的外观质量，这一点对于蒸汽和冷却水无能力长期稳定满足供应情况的生产厂家来说，更显出其优点。这说明目前通行的也认为是较好的连消法是受到一定条件约束的。如上述的蒸汽、冷却水的供应，以及操作人员的技能熟练程度等等。

    我厂1990年一个车间用15m³罐进行利福霉素生物发酵生产时，在年初使用全料消毒法，生产水平不高，后采用将葡萄糖与其他料分开消毒，接种前合并，结果发酵水平明显上升，改前22批平均3698u/ml，改后25批平均4856u/ml，提高31%左右。这又一次证明组合法对提高某些培养基的质量大有好处。

    但也有一些留待进一步研究的问题，如配方中某些料比例的调整等等。

    第三条纵观一下，不得不说，实验室的玻瓶规模是认真实现了的，而生产规模，不管装备容量大小，其符合率是很低的。为说明起见，以现行测定消后培养基的项目（PH、糖g%、氮mg%、磷r/ml）的波动情况作为一个衡量指标，如超过配方计算的数量，就认为是体积小于要求值；反之，体积过大了。见如下的一张统计分析图表。数据采自四川省长征制药厂1991年1—3月链霉素产生菌母瓶（SMMB）,子瓶（SMZB）,小罐（SMXG）,中罐（SMZG）,大罐（SMDG）以及土霉素产生菌小罐（TMXG）,中罐（TMZG）,大罐（TMDG）等的培养基消后的数据。横坐标表示以标准要求为0时左右偏离范围，每格为5%，纵坐标表示某一区间内出现的频数。图示充分说明摇瓶培养基制备时认真的结果，才使得消后质量波动较小，而生产罐除了PH一项外，其余三项都呈现大波动，其中除了体积控制不准不稳外，消毒过程发生反应造成损失也是有关的。

    若按这几项都符合配方要求的批数进行统计的话，见下表。

分析项目的结果全符合配方要求的罐批百分数统计表

 http://s13/middle/5366edfdhc06cf61a16ac&690

    其所以如此，有必要看看现在使用的一般方法。

    摇瓶：所用原料称量好后，分开或者全部用水进行溶解成一定的浓料液，最后都是用水加到所需要的体积为止。然后才计量分装。在灭菌时，控制消毒时间和温度，以稳定蒸发水分的数量。因而，使其制备的质量基本保持稳定一致。

    生产规模：实施有多种方法，一是实消；一是连消；一是分消合并。实消时是采取控制消前料液的体积，使用蒸汽压力在稳定的基础上，产生一定量的冷凝水体积补足。在连消时，则是靠消完料后消一部分水补足的。分消合并法，不管是实消还是连消方式，也都是如上面的方法控制体积的实现。铵理体积控制是没问题的。要知道这中间是有一个前提，这就是消毒培养时的蒸汽压力需要较长期稳定在一个水平，也就是消料时产生的冷凝水在一定的时间内有一个恒定值，一旦不能满足，不管是操作者多么有经验，要按配方实现也将是一件不容易的事。许多生产厂家的实际表明，所用蒸汽是极大不稳定，带来的是体积控制肯定是波动的。从这一点来说，并没有引起更多的人们注意。难怪一些选种工作者以及培养基配方研究者的抱怨：多么好的菌种或者多么好的配方一到生产罐就不灵了。其研究成就不易得到肯定。而大生产指挥者则说‘你的是小实验，经不起大生产的考验，不能放大。总之，这种互不相让的事常有表露。但问题始终没有一个清晰的解答。上述的一点粗略分析，有可能对解开疑难有所启发。不能实现规定的培养基质量要求，哪会有效果的显示呢！话也得回来说，大生产也是允许有一定波动啊！的确，所提供的培养基配方也没注明其波动幅度。这似乎一点也不能修改，范围有多大？那是今后引起注意的事了。不管怎样，生产上培养基制备的配制方法是需要改进的，

    从上面分析已有一个明显的结论。这就是现行的培养基制备工艺是存在问题。归纳为：工艺控制苛刻；质量不稳；配方自变。因此，需要改进。为此，提出一个方案。其方案应满足：最大的提高培养基内在的质量；消毒控制有较大允许波动范围，且保证彻底灭菌；配制后体积符合规定要求。

    基于原材料间存在不良反应时，一旦采用分配、分消的组合方式，可消除此类问题发生，对保证培养基质量及灭菌彻底。因此这里推荐的工艺是通称‘分消组合法’。

配方中原材料应如何分组？分成多少组？那些是可以一次配制？一次使用或多次使用，这要看具体品种的要求和装备情况了。在灭菌方式上，是采用实罐消毒法，或连消法，或无菌过滤法，都是可以任意采用的。不管用那一法，其后都必须用经过灭菌的水加足所要求的体积，这就是改进法的总体内容。

    在具体实施时，要有几个基本条件：一是罐内要有观察体积的计量刻度；二是料液输送管路系统严密而保证无菌；三是各分料的总体积的和不能超过全料时要求的数量；四是多次使用的分料用前检测其含量，使用时做到均匀；五是体积的控制应在组合罐内进行；六是组合前各个分料的温度应接近培养值。

    在这里得提醒一下，就是由于明显的改变了配制方法，带来的是内部质量上的差异，也会产生其它一些新问题，如有机氮源的蛋白质的变性要轻些，就会使培养基形成的泡沫情况不一样，可能会严重些。不注意调整如消沫剂的用量，就会影响前期条件的控制，直接影响新工艺的评价。这是说，配制工艺的改变，相应也要寻找合适的配方，这也是成功的一个基本条件。

    这种考虑培养基制备的三个标准实现的工艺，尚未实施过，其结果是否像描述那样美好，这留待生产验证了。

    用一个类比说明这种想法吧。有一个指令：画一根直线。就会有不少人，一顺手拿起笔在纸上一画，这个结果合格率可想而知。也会有人借用一把尺，画了了一条线。这后一种情况的结果可能会好些，但是当这把直尺的边缘有磨损而弯曲时，合格率不会比徒手好些。若这时是一位经验丰富而且熟悉情况的操作者，在画到尺的磨损部位时，将会小心翼翼的调整笔，以避免画线的弯曲，那时可能得到合格的直线。须知这是付出多么大的代价啊！-----一个熟练的操作者加上一个低效率。反之，借助于一把良好而合乎要求的尺子，要画一些合格的直线，只要是能初步懂得操作步骤和要求是人，就可迅速画出要求的线，不但合格率高，速度也是高的。这是前几年进行一次试验观察的结论。现在一些生产工艺规范也不是有类似的情况吗？我看现行培养基配制方法就是一例。