利用牙本质生长层组计数鉴定白鲸的年龄

 

罗  清

（长风海洋世界，上海 200062）

 

摘  要：一头圈养的雄性白鲸，数年来已脱离牙齿16颗，为了确定其年龄，取最近脱落的两颗牙齿标本做组织切片，经Harris苏木素染液染色后，置于显微镜下观察牙组织的形态结构并计数牙本质生长层组。根据计数结果推断其年龄约为33岁，证实该白鲸已进入老龄阶段。为了使其保持健康状态，尽可能地延长寿命，工作人员采取了一系列特殊的饲养管理措施，文章对此也做了简单介绍。

关键词：白鲸；年龄鉴定；牙本质；牙骨质；生长层组

中图分类号: S 917.4    　文献标识码: A

 

Age Determination in a Beluga Whale Using Dentinal Growth Layer Group Counts

 

LUO Qing

（Changfeng Ocean World, Shanghai 200062）

 

Abstract: A captive male beluga whale had lost 16 teeth over the past years. In order to determine his age tooth sections were taken on two teeth which he recently lost. After stained in Harris’ hematoxylin we observed the dental tissue shape and counted the number of dentinal growth layer groups under a low power microscope. The result showed that the beluga whale was around 33 years old. It proved that he had entered old age. The paper also introduced the special holding and husbandry management for maintaining his health and prolonging life.  

Key words: Beluga whale, Delphinapterus leucas, age determination, dentine, cementum, growth layer groups, GLG

 

    白鲸(Delphinapterus leucas)在分类学上属于齿鲸亚目一角鲸科，主要分布于北极和亚北极的季节性覆冰水域中^[1]。在十九、二十世纪，由于人为猎杀、有毒物质污染、栖息地减少、商业航运干扰以及天敌（虎鲸和北极熊）捕食等因素，致使白鲸的数量急剧减少^[2-3]。尽管白鲸被列入CITES附录Ⅱ和IUCN易危级，相关国家近年来也先后采取了种种保护措施，但一些地区的白鲸数量仍呈下降趋势，并有灭绝的危险^[4-5]。

    掌握野生白鲸种群的年龄结构，有助于了解白鲸的繁殖状况、评估其种群大小。根据数量增减的动态变化，可进一步评价白鲸的濒危程度和资源保护效果。要掌握野生白鲸种群的年龄结构，确定白鲸的年龄至关重要，而牙齿切片能提供可靠的年龄鉴定依据。国际上对此非常重视，针对牙齿标本的制备方法、牙本质生长层组的计数标准等问题，曾专门召开学术会议进行研讨^[6-7]。

    我馆饲养的一头老年雄性白鲸，多年来牙齿不断脱落。为了确定其年龄，针对个体更好地做好保健工作，我们将两颗牙齿标本做了组织切片，获得了较为准确的年龄信息，现报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料来源

    我馆饲养有一头老年雄性白鲸，于2003年12月从俄罗斯引进，体长4.1m，体重约900kg，进馆时已有多颗牙齿脱落，至今共脱落牙齿16颗。本文试验材料取其牙齿2颗，其中一颗于2009年4月7日脱落，为左上颌第5颗，牙齿全长25mm，牙颈部直径9mm，编号LU5；另一颗于2009年5月5日脱落，为左下颌第5颗，牙齿全长34mm，牙颈部直径9mm，编号LL5。两颗牙齿均结石沉积很厚，釉质磨损严重（图1）。

 

图1  白鲸的牙齿标本

Fig. 1  Two tooth samples of the beluga whale

 

1.2  切片制备

    牙齿LU5以10%的硝酸溶液脱钙75h，常规石蜡包埋，纵向切片，切片厚度为10μm，Harris苏木素染液染色2h，1%盐酸酒精分化，温水蓝化，最后封片。    牙齿LL5的切片制备方法同上，只是脱钙120h，切片厚度为5μm。

1.3  年龄鉴定方法

白鲸的牙齿均为同型齿，终生不换牙。随着年龄的增长，同时受外界环境变化的影响，牙齿不断吸收营养，钙质不断沉淀，会使牙髓腔逐渐封闭，并使牙本质（Dentine）和牙骨质（Cementum）形成类似树木年轮的纹理^[8]。因此，观察牙组织的结构和形态，计数牙本质和牙骨质上的生长层组（Growth layer group, GLG），进而确定白鲸的年龄。

为了降低人为计数误差，选择两颗牙齿中间部位的染色清晰的切片，分别由8个人独立读片计数。由于8个人此前都没有相关经验，计数前，先由笔者依据国外相关文章向大家介绍白鲸牙齿的组织结构和生长层组的定义，并预览文献图片和切片实物。

2  结果

2.1  牙组织的形态结构

将牙齿切片置于显微镜下观察，可见两颗牙齿的髓腔均已完全闭合。从新生儿线（Neonatal line）向髓腔生长的牙本质由一系列明暗相间的弧形轮纹组成，每一个界限分明的轮纹层次定义为一个生长层组，每个生长层组又包含若干亚层（图2）。包裹在牙本质外面的是牙骨质，牙骨质从新生儿线向外侧延伸，由明暗相间的条形纹组成，每一根条形纹定义为一个生长层组（图3）。

 

图2  牙本质局部照片显示的若干生长层组  ×40

Fig. 2  Partial section of dentine, showing several GLGs

 

 

图3  牙骨质局部照片显示的若干生长层组  ×40

Fig. 3  Partial section of cementum, showing several GLGs

 

2.2  生长层组计数结果

牙齿LU5切片染深紫红色，部分先天齿质（Prenatal dentine）因牙齿磨损而缺失，牙骨质扭曲、断裂并与牙本质分离。牙齿LL5切片染淡蓝紫色，结构完整，但牙骨质上的条形纹层次不够清晰，计数误差较大。因此，仅对两颗牙齿的牙本质进行生长层组计数，一个生长层组代表年龄为一岁，计数结果见表1。经t检验两组数据无显著差异，由此推断该白鲸的年龄为33岁。

 

表1  两颗牙齿的牙本质生长层组计数结果

Tab.1  The growth layer groups count results of two teeth

牙齿编号 Number of teeth	读片计数者编号 Number of readers								平均年龄 Average	标准差 SD
	A	B	C	D	E	F	G	H
LU5	34	33	32	30	31	34	33	33	32.50	1.41
LL5	36	33	32	28	32	35	33	36	33.13	2.64

 

3  讨论

    牙齿标本在制作切片前要进行脱钙处理，脱钙时间与动物的年龄呈正相关，年龄越大脱钙时间越长^{[7, 9]}。本试验中，牙齿LU5脱钙时间稍短、切片相对较厚，Harris苏木素染色后着色较深，牙骨质有断裂；牙齿LL5延长了脱钙时间、切片较薄，观察效果较为理想。有报道称使用姬姆萨染液、Harris苏木素染液或Mayer苏木素染液均可用于牙齿切片染色^[10]，但为了获得最佳的染色效果，从而更有利于准确计数生长层组，还需要进一步试验研究。

    关于牙本质生长层组与白鲸年龄的关系，即一个生长层组是代表一年还是半年的问题，国际上一直存在争议。以往的研究认为白鲸的牙齿每年增加两个生长层组，即一个生长层组代表半年^[11]。最近利用放射性碳素测定白鲸牙齿的生长层组表明，一个生长层组代表一年而不是半年^[12]。假设按照一个生长层组代表半年来计算，我馆饲养的此白鲸的年龄则在17岁左右，这与该白鲸的身体特征明显不符。因此，本文中白鲸的年龄鉴定是以一个生长层组代表一年为依据的。

    我们通过牙本质生长层组计数推断此白鲸的年龄为33岁，但由于其牙釉质磨损严重、牙髓腔已完全闭合，所以其真实年龄可能更高。白鲸的寿命一般为30年左右^[13]，据此可以说我馆饲养的这头雄性白鲸已步入耄耋之年。两颗牙齿（尤其是LL5）的部分牙本质片段显示弧形轮纹距离较近且着色深浅相似，八位读片计数者在生长层组及其亚层的界定上存在不同程度的分歧。另外，有资料显示牙齿在颌骨的位置影响生长层组的最大计数值，靠颌骨后侧的牙齿的生长层组计数值偏高^[14]。因此，该白鲸的年龄鉴定结果不一定十分准确，但通过牙本质生长层组计数来鉴定白鲸的年龄是完全可行的，此方法值得借鉴和深入研究。

    在确定了年龄之后，针对该老年白鲸，我们制定了特殊的饲养操作流程。一般来说，老年动物能量需求较少^[15]，在食物营养方面，适当调整高热量饵料（如鲅鱼、鲱鱼）的投喂量、搭配鱿鱼、多春鱼、沙丁鱼等，同时有选择地增加维生素和矿物质的补充量，以使营养摄取更加全面、均衡。在健康检查方面，每天早晨测体温并肉眼检查体表、眼睛、口腔、生殖裂等有无异常，每周采集呼吸孔分泌物、胃液和粪便样本进行显微镜检查，每月采血一次做血液常规和生化项目的检查。在行为训练方面，以医疗行为为主，停止训练那些需要剧烈活动的表演行为，如跳跃、顶球等。该白鲸平时游速较慢、对周围事物缺乏好奇心，因此在环境丰容方面，我们采取多种形式的人为互动，陪伴它玩耍，以增加其活动量和心理刺激。上述饲养管理措施，对各种老年鲸类动物的科学饲养都具有普遍的借鉴意义。

 

参考文献：

[1]  Mark Carwardine. Whales, Dolphins and Porpoises. 2nd ed[M]. London: Dorling Kindersley Limited, 1999.

[2]  National Marine Fisheries Service. Conservation Plan for the Cook Inlet beluga whale (Delphinapterus leucas)[R]. National Marine Fisheries Service, Juneau, Alaska, 2007.

[3]  Daniel Martineau, Karin Lemberger, André Dallaire, et al. Cancer in Wildlife, a Case Study: Beluga from the St. Lawrence Estuary, Québec, Canada[J]. Environmental Health Perspectives, 2002, 110(3): 285-292.

[4]  Hobbs R C, K E W Shelden, D J Rugh, et al. 2008 status review and extinction risk assessment of Cook Inlet belugas (Delphinapterus leucas)[R]. Seattle: Alaska Fisheries Science Center. 2008: 1-116.

[5]  Carlos M Alvarez-Flores and Mads Peter Heide-Jørgensen. A risk assessment of the sustainability of the harvest of beluga (Delphinapterus leucas) in West Greenland[J]. ICES Journal of Marine Science, 2004, 61(2): 274-286.

[6]  Perrin W F and Myrick A C. Growth of odontocetes and sirenians: International Conference on Determining Age of Odontocete Cetaceans and Sirenians[M]. Cambridge, Englend: Heffers Printers Ltd, 1980, 3: 1-50.

[7]  Christina Lockyer, Aleta A. Hohn, D. William Doidge, Mads P. Heide-Jørgensen, and Robert Suydam. Age Determination in Belugas (Delphinapterus leucas): A Quest for Validation of Dentinal Layering[J]. Aquatic Mammals 2007, 33(3), 293-304.

[8]  LI Hai-Yan, ZHANG Xian-Feng, Hidehiro KATO and Toshihide IWASAKI. Age determination and growth of spotted dolphins Stenella attenuata of Pacif ic coast of Japan[J]. Acta Zoologica Sinica. 2005, 51(3): 476-485.

[9]  Rosas F C W, Barreto A S and Monteiro E L D. Age and growth of the estuarine dolphin (Sotalia guianensis) (Cetacea, Delphinidae) on the Parana coast, southern Brazil[J]. Fishery Bulletin. 2003, 101(2): 377-383.

[10]  Molina D M and J A Oporto. Comparative study of dentine staining techniques to estimate age in the Chilean Dolphin, Cephalorhynchus eutropia (Gray, 1846)[J]. Aquatic Mammals. 1993, 19(1): 45-48.

[11]  Arthur D. Goren, Paul F. Brodie, Stephen Spotte, et al. Growth layer groups (GLGs) in the teeth of an adult Beluga whale (Delphinapterus leucas) of known age: evidence for two annual layers[J]. Marine Mammal Science. 1987, 3(1): 14-21.

[12]  Stewart R E A, Campana S E, Jones C M and Stewart B E. Bomb radiocarbon dating calibrates beluga (Delphinapterus leucas) age estimates[J]. Canadian Journal of Zoology, 2006, 84(12): 1840-1852.

[13]  Fisheries and Oceans Canada (DFO). Stock assessment of Northern Quebec (Nunavik) Beluga (Delphinapterus leucas)[R]. Canadian Science Advisory Secretariat, Science Advisory Report, 2005/020, 3 p.

[14]  Daniel J Vos. Cook Inlet beluga age and growth[D]. Anchorage, AK: Alaska Pacific University. 2003, 69. p.

[15]  Canadian Council on Animal Care. 1984. Guide to the care and use of experimental animals, vol. 2[S]. Ottawa: Canadian Council on Animal Care.