鲨鱼外周血的常规检查方法及细胞形态观察

罗  清

（长风海洋世界，上海 200062）

    鲨鱼在分类学上属于软骨鱼纲，板鳃亚纲，侧孔总目。它们的共同特征是骨架由软骨构成，躯体呈流线型，皮肤覆有盾鳞，鳃裂每侧5-7个，牙齿数层可更换^[1]。在国内，几乎所有的上规模的水族馆均引进鲨鱼进行展示，但现有的医疗技术水平难以满足鲨鱼健康管理的要求，鲨鱼一旦患病，饲养管理人员往往感到无能为力。血常规检查在人类及其他许多动物的健康检查、疾病诊治过程中具有不可或缺的价值，同样适用于评估鲨鱼的健康状况。在鲨鱼血液学检查方面，目前国内尚未见报道，本文以沙虎鲨（Carcharias taurus）为例，着重介绍鲨鱼血常规检查的操作方法和外周血细胞形态，以期为相关人员提供借鉴和帮助。

1  实验材料

1.1  实验动物  选择我馆饲养的两头健康成年雌性沙虎鲨。其中一头体长2.8米，体重约200kg；另一头体长2.6米，体重140kg。

1.2  血液采集  鲨鱼采血方法有多种，对于体型较大的沙虎鲨，可选择尾部外侧动脉采血。采血时由四名潜水员手持自制的聚乙烯塑料袋下水捕捉鲨鱼。待鲨鱼钻入塑料袋后，立即卷起袋口并将鲨鱼拖至水池边。然后掏出鲨鱼尾鳍，使尾部露出水面。局部消毒后用5ml或10ml的无菌注射器、20G（0.9mm）针头沿尾部侧线垂直进针。用力刺穿皮肤，进入血管时会感到阻力突然消失，见回血后缓慢抽针座至所需血量。将1-2ml血液注入EDTA-K₂抗凝管中，混匀后及时送实验室检查。 

1.3  仪器及试剂  OLYMPUS CX31生物显微镜，TRIAC 420200离心机，XF-1血红蛋白仪，Eppendorf移液器，改良Neubauer血细胞计数板，改良Natt-Herrick稀释液，Wright-Giemsa染液。

2  操作方法

2.1  红细胞和白细胞总数  用移液器取Natt-Herrick稀释液990μl放入一次性塑料试管中，再加入10μl抗凝全血，即以1:100进行稀释。充分混匀，然后用移液器吸取细胞悬液，充入改良Neubauer血细胞计数板的计数池内。静置2~3min后置于显微镜下用低倍镜或高倍镜分别计数白细胞和红细胞。白细胞计数区为四角的四个大方格，红细胞计数区为中央大方格内的四角和正中5个中方格（见图2）。计数时对于压线的细胞应采用数上不数下，数左不数右的原则，以保证计数域的一致性，使计数准确^[2]。计数后通过换算分别得出白细胞、红细胞总数。白细胞数/L=四个大方格中白细胞数÷4×100×10⁷(÷4得到每个大方格（0.1μl）内的白细胞平均数，×100是因为血液稀释了100倍，×10⁷是将0.1μl换算为1L)，即白细胞总数=四个大方格中白细胞数÷4×10⁹/L。红细胞数/L=5个中方格内的红细胞数×5×100×10⁷（×5是将5个中方格换算成一个大方格（0.1μl），×100是因为血液稀释了100倍，×10⁷是将0.1μl换算为1L），即红细胞总数=5个中方格内的红细胞数÷200×10¹²/L。

图2  改良Neubauer血细胞计数板的计数池。A-D为白细胞计数区，1-5为红细胞计数区

2.2  血红蛋白测定  取20μl抗凝全血，加入5ml氰化高铁血红蛋白（HiCN）转化液中，充分混匀，以3000r/min离心5min，弃去沉淀，以消除细胞核的干扰。以标准液校正血红蛋白仪，然后将待检样品吸入仪器进行测定，直接读数即得血红蛋白量，单位为g/L。

2.3  红细胞比容测定  红细胞比容也称红细胞压积，测定时用毛细管吸取混匀的抗凝全血，将毛细管的一端插入胶泥中，封口，然后把毛细管放在离心机的比容槽上（封口的一端向外），以12000r/min离心5-10min，最后量取毛细管中压实红细胞长度和血液总长度，计算其比值。

2.4  红细胞平均值测定  红细胞平均值包括平均红细胞体积（MCV）、平均红细胞血红蛋白含量（MCH）和平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）。MCV指每个红细胞的平均体积，以fL(10^-15L)为单位。MCH指每个红细胞内血红蛋白的平均量，以pg(10^-12g)为单位。MCHC指平均每升红细胞中所含血红蛋白量，以g/L为单位。这三项数据是通过前面检测的红细胞总数、血红蛋白量及红细胞比容计算出来的。具体计算公式如下：MCV（fL）=红细胞比容/每升血液中红细胞总数×10¹⁵，MCH（pg）=每升血液中血红蛋白量/每升血液中红细胞总数×10¹²，MCHC（g/L）=每升血液中血红蛋白量/红细胞比容。

2.5  白细胞分类计数  取血液一小滴置于载玻片的一端，以专用推片或盖玻片的一端，放在血滴前方缓慢后移接触血滴，血滴即沿推片散开。将推片与载玻片保持30º~ 45º夹角，匀速推至载玻片的另一端，载玻片上即留下一层血膜。血涂片制成后应立即在空气中晃动使其迅速干燥，以免血细胞皱缩。然后将血涂片平置于染色架上，滴加Wright-Giemsa染液数滴，使其迅速覆盖整个血膜染0.5~1min，按1:1加磷酸盐缓冲液或蒸馏水，用洗耳球轻吹使之与染液充分混合，5min后用清水冲去染液，待干后镜检。油镜下分类计数100个白细胞，得出各种白细胞所占百分率。

3  细胞形态

3.1  红细胞  鲨鱼外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后红细胞呈卵圆形，细胞核呈圆形或椭圆形，细胞质不着色或染淡紫色，细胞核染紫红色（见图3）。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后成熟红细胞大多呈椭圆形，细胞质染淡红色，细胞核呈圆形，多居中或稍偏于一侧，染深紫红色（见图4）。在健康鲨鱼的外周血中也常常可以见到少量未成熟红细胞。未成熟红细胞呈圆形或椭圆形，细胞质呈现出不同程度的嗜多色性，常染成蓝色或蓝灰色，有时可在细胞质内看到Howell-Jolly体，细胞核大而居中，染深蓝紫色。

图3  改良Natt-Herrick稀释液稀释后的血细胞形态。1为红细胞，2为白细胞

图4  Wright-Giemsa染液染色后的血细胞形态。1为红细胞，2-3为异嗜性粒细胞，4为淋巴细胞，5为单核细胞，6为嗜酸性粒细胞，7为嗜碱性粒细胞，8为凝血细胞

3.2  白细胞  鲨鱼外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后粒细胞染黑紫色；单核细胞个体大于其它细胞，染淡紫色；淋巴细胞个体较小，染深紫色，看不到明显的细胞质（见图3）。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后，白细胞可明显区分为异嗜性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞五种。各种正常成熟白细胞形态如下：异嗜性粒细胞有两种形态，其中一种细胞呈圆形或稍不规则，细胞质是无色的，没有明显的颗粒，细胞核多为1-2叶，染深蓝紫色；另一种异嗜性粒细胞形状不规则，细胞质中有染成粉红色的细杆状颗粒，细胞核染紫红色，分1-4叶不等，单个未分叶核形状多不规则。嗜酸性粒细胞与异嗜性粒细胞大小相似，细胞质中充满红色圆形颗粒，细胞破碎后嗜酸性颗粒常分散在细胞核附近，细胞核一般为1-2叶，2叶居多，染蓝紫色。嗜碱性粒细胞在鲨鱼外周血中很少见^[3]，笔者所见嗜碱性粒细胞呈不规则形，细胞质中含有一些大而深染的嗜碱性颗粒，细胞核未分叶。淋巴细胞按个体大小可分2-3种，反映了不同的成熟阶段^[4]，小淋巴细胞呈圆形，圆形细胞核染成深蓝色，细胞质很少，通常是在核的外面显现很窄的边或锯齿状轮廓；大淋巴细胞形状不完全规则，细胞质相对较多，染淡蓝色。单核细胞多呈圆形，也有不规则形，细胞质丰富，染成淡蓝色或灰蓝色毛玻璃样，有时可见空泡，细胞核呈不规则圆形、肾形或马蹄形等，核染色质疏松染紫红色（见图4）。

3.3  凝血细胞  鲨鱼外周血经改良Natt-Herrick稀释液稀释后可见凝血细胞个体较小，染色较粒细胞浅，染浅紫色。血涂片经Wright-Giemsa染液染色后，可见凝血细胞有梭形、椭圆形、圆形等多种形状，细胞核多为椭圆形或圆形，染紫红色至深紫色不等，细胞质较少，染淡紫色。圆形的凝血细胞与小淋巴细胞相似，只是核染色质相对疏松着色稍淡，细胞质着色较浅，有时含有少量嗜酸性颗粒（见图4）。

4  讨论和小结

    鲨鱼外周血细胞与禽类比较接近，红细胞、白细胞和凝血细胞均含有细胞核。另外，为维持较高的血浆渗透压以适应海水环境，鲨鱼血液中含有高浓度的尿素、氧化三甲胺、钠离子、氯离子等^[5-8]。因此，在进行红细胞和白细胞计数时，特采用改良Natt-Herrick稀释液（1000ml蒸馏水中加入氯化钠17.38g，尿素31.5g，硫酸钠2.5g，磷酸氢二钠2.91g，磷酸二氢钾0.25g，甲基紫2B 0.1g，37%甲醛7.5mL）^[9-10]。根据健康鲨鱼外周血中的红、白细胞数量，一般来说用改良Natt-Herrick稀释液按照1:100稀释全血是比较合适的。若遇到红细胞或白细胞过高的样本，可增加稀释倍数；反之，若红细胞或白细胞过低可降低稀释倍数。

    关于鲨鱼白细胞分类计数，目前在国际上尚没有统一的命名和分类标准，如Arnold将细胞质中含有染成粉红色细杆状颗粒的白细胞判定为嗜酸性粒细胞，将凝血细胞与白细胞一起分类计数^[10]。然而，细胞质中含有染成粉红色细杆状颗粒的白细胞与公认的嗜酸性粒细胞在细胞质颗粒和细胞核形状方面都存在明显差异，依据禽类的传统分类方法，笔者将其归入异嗜性粒细胞^[11]。另外，考虑到检验人员的操作习惯，同时便于临床医师参考，笔者建议在涂片做白细胞分类时，最好不要将凝血细胞计数在内。

    鲨鱼血常规检查的目的是评价其健康状况，为疾病的诊断、疗效观察、预后判断提供依据，因此，了解各项指标的临床意义亦很重要。白细胞总数升高通常与感染及炎症有关，白细胞总数降低伴随淋巴细胞减少或中性粒细胞升高表明应激反应或脓毒症^[12-13]。异嗜性粒细胞类似于哺乳动物的中性粒细胞，具有较强的噬菌功能，对机体有重要的保护作用，感染性疾病、应激等可导致异嗜性粒细胞增多。嗜酸性粒细胞也可以吞噬细菌和其他外来物质，但吞噬能力没有异嗜性粒细胞强。一般认为嗜酸性粒细胞与胃肠道、皮肤、鳃丝的抗原刺激和寄生虫感染有关^[14]，但也有人认为鲨鱼嗜酸性粒细胞升高与寄生虫感染无关^[15]。嗜碱性粒细胞在鲨鱼外周血中很少见，其功能尚未明确，可能如其他高等脊椎动物一样，参与过敏反应。淋巴细胞具有重要的免疫功能，某些病毒性感染症可见淋巴细胞数量上升，各种引起异嗜性粒细胞增多的原因均可导致淋巴细胞相对减少。在更高等的脊椎动物中，单核细胞可分化成巨噬细胞，不仅具有强大的吞噬功能，而且在特异性免疫中也发挥着重要作用，但在鲨鱼血液中，其功能尚不清楚，需进一步深入研究。红细胞总数、血红蛋白量、红细胞比容以及红细胞平均值测定主要用于评价鲨鱼的贫血类型或脱水，其临床意义与哺乳动物相似，无需赘述。需要注意的是，不同的盐度环境或不同的采血部位，鲨鱼的血容量会有所不同，对红细胞比容测定有一定影响，进而可影响临床判断^[16-17]。另外，鲨鱼的凝血细胞相当于哺乳动物的血小板，但是凝血细胞不仅参与血液凝集，而且也具有免疫功能^[18]。

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