分子生物学实验中常见的问题与对策 34

1． 关于Southern杂交
1.1 影响Southern杂交实验的因素有哪些？
影响因素主要有：DNA纯度、目的DNA在总DNA中所占的比例、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性、探针与目的DNA间的同源性、杂交效率以及洗膜终止点等。
1.2 在Southern杂交实验各步操作中会有哪些问题以及应对措施？
DNA制备：在提取DNA的过程中，尽可能多的除去如蛋白质、脂质等杂质，纯度越高越好。如：如果DNA样品中有太多的杂质，会降低下一步的酶切效率。
酶切：为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA（消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好），且加入不能超过1/10反应体系体积的酶液（内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用），在最适温度下消化1-3hr。消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。如果消化效果不好，可以延长消化时间，或者放大反应体积，或者补充酶再消化。如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
电泳分离：一般用于Southern杂交的电泳胶是0.8%琼脂糖凝胶。根据实验目的决定酶切DNA的量。一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。如果量过少的话，条带会很暗，不利于观察，且影响转移效率；如果量过多的话，条带脱尾严重，分离效果达不到。
DNA转移：要取得好的转移效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；注意不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。
探针：进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。当用放射性物质标记时，标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。探针的比活性最好大于109计数/分/μl。
杂交：杂交前要进行预杂交，以封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
洗膜与检测：在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。

2． 关于细菌的蓝白斑筛选法筛选转化子
2.1蓝白筛选平板上只出现蓝斑或白斑极少的原因及解决方法？
可能的原因分析：一、质粒转化的宿主菌不符合要求，即其编码完整的β-半乳糖苷酶基因而非N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因；二、重组质粒连接效率低或者自连严重；三、插入片段太短，并且刚好和lacZ使用同一个读码框，造成半乳糖甘酶具有部分活性从而表现假阴性结果；四、内切酶产生星号活力，外源基因插入到MSC以外的部分，未破坏半乳糖甘酶活性从而表现假阴性结果。
可能的解决方法：一、用不含抗生素的X-gal来检测宿主菌，出现蓝斑，则说明宿主菌不符合实验要求，更换宿主菌重新实验；二、重做连接和转化，注意使用的双酶切，并且内切酶不要是同尾酶，严格按照使用说明操作；三、如果目的基因本身片段太短，则可在 PCR扩增时适当目的基因两侧添加一些碱基对；四、严格按照内切酶的使用说明操作，此外，在挑白斑菌落提质粒做酶切检测的同时也要挑一些蓝斑菌落进行检测，防止因假阴性造成遗漏。
2.2蓝白筛选平板上只出现白斑，且白斑经检测后发现多为非阳性克隆的原因及解决方法？
可能的原因分析：一、所用抗生素失效或质粒转化的宿主菌产生了与载体质粒相同的抗药性造成加阳性结果；二、载体质粒问题，比如酶切插入位点设计问题造成载体质粒不能编码有效的α-互补片断从而表现出假阳性结果；三、X-gal保存不当，失效；四、培养时间及温度等影响因素。
可能的解决方法：一、更换有效的抗生素重新实验，若非抗生素失效则用含抗生素的平板培养宿主菌，能够生长则表明宿主菌已产生抗药性，更换宿主菌重新实验；二、将空质粒转化后的菌在含抗生素的X-gal平板上培养，出现白斑，则说明质粒优问题，选取合适质粒重新实验；三、X-gal不稳定，实验前可以用一点试试看其是否已经失效；四、经验表明做蓝白筛选时，转化，涂板37摄氏度培养12到16小时后，要放在4摄氏度进一步显色，一般在放几个小时后可使显色反应充分。
2.3蓝白筛选平板上同时出现白斑蓝斑，但经检测后发现白斑为阴性克隆，蓝斑为阳性克隆的原因及解决方法？
原因分析：所用抗生素失效或宿主菌产生了抗性从而出现假阳性现象，又因为插入的目的基因片段太短，并且刚好和lacZ使用同一个读码框，造成半乳糖甘酶具有部分活性从而表现假阴性现象。
解决方法：更换有效的抗生素重新实验，若非抗生素失效则用含抗生素的平板培养宿主菌，能够生长则表明宿主菌已产生抗药性，更换宿主菌重新实验；PCR扩增时适当延长目的基因；在挑白斑菌落提质粒做酶切检测的同时也要挑一些蓝斑菌落进行检测，防止因假阴性造成遗漏。

3．关于外源基因在大肠杆菌中的表达
3.1影响外源基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？
启动子的结构：启动子-35区和-10区序列与通用转录序列一致，间距为17 bp，大于17bp效果差，不同产物选用不同启动子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL启动子效果好。
表达载体的选择：载体分子量不宜过大，以2.5-5.6kb为佳，高拷贝，不同产物选用不同类型表达载体。
外源基因的结构： 细菌中基因表达对密码子有偏爱性，不偏爱的稀有密码子（AGA、AGG）表达效果差，特别当有AGA-AGG连续序列存在时表达效率低。
mRNA的结构与稳定性：启始密码子：表达效率AUG>GUG>UUG；SD序列：较长的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列与AUG间距一般6-12bp，4-10bp较佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻译区，若有5’-UGAUCU，则有增强作用；mRNA形成二级结构时，可产生茎环，若SD序列、AUG位于茎环内或发夹内，转译受抑制；在茎环外则有利于转译。REP序列可阻止mRNA降解，偏爱密码子 也起保护作用。
除上述影响因素外还有蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。
3.2 目的蛋白以包涵体的形式表达，如何使其正确折叠？
一、共表达分子伴侣、折叠酶、硫氧还蛋白
二、二硫键异构酶（PDI）、DsbA、DsbB处理
三、降低合成速度：弱启动子、低温
3.3如何进行对宿主有毒性的蛋白的表达，如：在大肠杆菌中表达抗菌肽？、
由于其杀菌活性, 抗菌肽不能在大肠杆菌中直接表达。可采用与人胰岛素原(mhP1)、麦芽糖结合蛋白（MBP）等大分子蛋白 融合表达抗菌肽形成非活性表达体的方式可避免直接表达时宿主菌的“自杀”,也可保护抗菌肽免受蛋白酶的降解，同时容易分离。提出的包涵体用一定的酶切后表现抗菌活性。
3.4如何进行在大肠杆菌中不稳定的外源蛋白？
一、融合表达，形成包涵体
二、改造改造信号肽序列和结构，使蛋白实现周质表达或分泌表达
三、使用缺乏蛋白水解酶基因或蛋白水解酶敏感和识别位点改造过的工程菌