分子生物学实验常见问题分析及对策-21

一，蓝白斑筛选
此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG 的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。然而当外源DNA 插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。由于没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子.
不过实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况.即蓝色菌斑也有可能含外源基因。据最新报道，大概有30%的假阴性. 若形成的白斑很多，但仍不是阳性克隆，需仔细检查你的质粒载体和目的片段连接转化时间温度控制好 避免载体自连 并且排除你的酶切插入位点等没有出现设计问题
还有，进行蓝白斑筛选时，平板上没有菌生长，可能由于操作和试剂用量有关如不同的公司试剂用量要求并不一样。有以下建议：
（1）先将IPTG和X-gal(两者可混合）涂于Amp板上，将平皿正置放于37度约30min，待IPTG和X-gal完全吸收后，再将（连接体系转化大肠杆菌感受态细胞，加入LB培养1小时所得的）菌体涂板。
（2） 可以先涂IPTG和X-gal，也可以和菌液一起涂，但要主意一点IPTG浓度不能太高，因为他对菌体是有毒性的。实验结果是没有长菌，应该不是筛选的问题，而是其他的问题，如果有相应的对照，比如检验感受态活力等就比较好分析了。
（3） 另一做法一般是把Amp、X-gal、IPTG在倒平板时就加入固体LB培养基中，如果是涂板时现加，如果浓度合适应该也没问题的。不长菌有很多原因的，或者Amp浓度过高，或者细胞全死了.....建议下次做个连接PCR检测后确定连接没问题，然后转化（化转90秒热激）时加上阴性、阳性对照。按上面的方法试试，严格按操作步骤进行，肯定没问题。
若用T载体连接，有时会出现蓝白斑，但有时出现全是白斑。
原因：
1）X-gal涂得不够或IPTG加得不够，因为大肠杆菌的有些菌株如JM109，其LacI(B-半乳糖苷酶的调节基因）是突变型的，即为lacIq，相对野生型（如DH5a）的LacI来说，其对乳糖操纵子的抑制要强10倍。
2）显色的时间可能不够，延长时间或放入低温冰箱可加强显色。
3）连接产物里面空载的载体本来就极少，这可能是主要原因。
T载体的制备实际上通过酶切和加T的酶反应得来的，由于酶反应不可能100％向单方向彻底进行，所以在T载体试剂中总是有未切开的环状载体分子和线性未加T的载体分子存在的，在连接反应进行时，这些线性载体分子又会环化，转入细菌，产生蓝色菌落。所以在连接转化的细胞中肯定是有蓝色菌落的。
但有时涂板培养后，却看不见有蓝色菌落，实际上是一种假象，以为100％有插入子。为什么说是一种假象呢？
这与T载体质量有关，某批次的T载体或某些公司的载体制备纯化好，空载的分子本来就少，况且我们进行实验时目的片段往往过量，所以连接产物中重组分子占绝大绝大多数，转化细胞当然蓝色的所占比例极少极少，一般只涂一个或两个平板，蓝色的菌落被涂的可能性极低，故好像全是白色菌落了。如果将所有细胞都涂的话，且不能涂得过密，肯定会有蓝色菌落的出现。
二，southern杂交
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量
Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列,它包括下列步骤:
　　(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。
(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。
(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。
(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多因素,包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA间的配对情况等。在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(>109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。
将DNA从凝胶中转移到固体支持物上的方法主要有3种:(1)毛细管转移。本方法由Southern发明,故又称为Southern转移(或印迹)。毛细管转移方法的优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱。(2)电泳转移。将DNA变性后,可电泳转移至带电荷的尼龙膜上。该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。(3) 真空转移。有多种真空转移的商品化仪器,它们一般是将硝酸纤维素膜或尼龙膜放在真空室上面的多孔屏上,再将凝胶置于滤膜上,缓冲液从上面的一个贮液槽中流下,洗脱出凝胶中的DNA,使其沉积在滤膜上。该法的优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(<1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高
主要操作步骤：
　　1．琼脂糖电泳
　　（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～50μg。
　　（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。
　　（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。
　　2．印迹转移
　　（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。
　　
 
Southern印迹杂交转膜示意图
（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。
（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。
（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。
（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。
（6）虹吸转移12-16h。
3．固定DNA
　　（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。
　　（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。
　　（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。
4．预杂交
　　（1）将膜浸入5×SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。
　　（2）将预杂交液事先在65℃ 预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。
　　（3）65℃预杂交1h 以上，不时摇动。
5．杂交
　　（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。
　　（2）将杂交袋放入65℃ 水中杂交过夜。
6．按下列条件洗膜
　　2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温 5min /2次
　　0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃ 15min /2次
7．免疫酶联检测
　（1）偶联反应
　　①用中和液 洗膜2min，室温。
　　②用封闭液50ml洗膜30min，室温，轻摇。
　　③用中和液将稀释抗体-Dig –Ap 至750 mU/ml ，将膜封入杂交袋，加入5 ml稀释抗体轻摇50min。
　　④用中和液 50 ml洗膜，10min ×2次，室温，轻摇，除去未结合的抗体。
　（2）显色反应
　　①用平衡液20 ml平衡膜2min。
　　②将膜装入杂交袋中，加入5ml显色液，避光30min 左右，当出现颜色时不要晃动。
　　③用TE洗膜终止反应。
④80℃烤干。
注意事项
1要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。
2转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。
3转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
4注意同位素的安全使用。
改进的southern方法
对Harley 等创建的经典Southern blotting 方法进行改进，采用无放射污染的生物素标记的探针进行分子杂交，建立了一种低背景显示端粒谱带的方法，建立生物素标记探针杂交检测端粒DNA 的方法，关键是要得到低背景而高清晰度的杂交条带，从而准确分析端粒DNA 的长度．笔者通过多次试验发现，有以下3 方面值得注意．第一，要保证大分子量基因组DNA，在DNA 的抽提过程中，操作要缓慢轻柔，以防止大分子DNA 断裂．其次，DNA 酶切要完全，消化时间要足够（37 ℃过夜），酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离，在紫外灯下呈均匀瀑布样分布．第二，杂交条件也是影响实验结果的主要因素．但杂交条件包括许多方面，其中以凝胶处理、杂交液成分和杂交温度等为重要影响因素：（1） 凝胶处理：由于制备和电泳过程中始终保持双链结构。为了有效实现Southern 印迹转移，对凝胶做预处理十分必要．为了使DNA片段在合理的时间内从凝胶中移动出来，必须将最长的DNA 片段控制在大约2 Kb以下，DNA 的大片段必须被打成缺口以缩短其长度．因此，通常是将凝胶用0.25 mol/L 的HCL 溶液短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液浸泡，使DNA 变形并断裂形成较短的单链DNA，这样产生的DNA 片段可高效率地从凝胶上迅速转移．然而需特别注意的是防止脱瞟呤反应过甚，否则DNA 断裂成过小的片段而不能有效地结合到固相支持物上，以10～15 min 为宜（凝胶上的溴酚蓝变为黄色）。（2） Southern 印迹转移的固相支持物建议使用带正电荷尼龙膜，结合DNA 能力更强。（3） 杂交温度的确定：一般情况下是按照探针、靶基因和杂交液的特性确定合适的杂交温度，本研究杂交温度55 ℃左右时效果较好，温度过低，杂交背景过深，温度高则探针与端粒DNA 结合效率下降。
三，外源基因在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌具有生长快速、生长周期短、安全性好、可以进行高密度培养和适合表达不同基因产物 等特点, 是许多外源基因表达系统中最好的一种, 大量的有价值基因产物在大肠杆菌中获得了表达。
1 质粒拷贝数和质粒稳定性
质粒在细胞分裂过程中一般自由分布，没有选择压力时丢失率很低, 一般为10-5-10-6代。但是如果细胞含有的质粒拷贝数过高，或带有对宿主细胞有毒副作用的基因，以及以高密度或连续培养的方式培养工程菌时，质粒的丢失率可能会大大增加。克隆有外源基因的质粒载体转化到大肠杆菌受体细胞后，会产生一系列的生理效应, 影响到重组质粒的稳定性。如带有重组质粒的大肠杆菌在培养过程中，由于的缺失、插入和重排导致重组质粒的结构不稳定，以及质粒的par功能区的破坏，重组质粒的不稳定是影响外源基因表达的主要问题之一，尽管人们采用以rec--突变体细胞作宿主菌、降低生长速度、选用含有par功能区的质粒作为克隆载体质粒等方法来提高重组质粒的稳定性，但是利用带有编码抗药性标记的质粒和提供添加抗生素的培养基,抑制不含有质粒的菌体生长是常用的方法。然而这种方法也有其局限性，一方面菌体细胞周质中的抗生素分解酶会渗漏到培养基中，分解抗生素，培养基的选择压力消失另一方面含有抗生素的产品使用时受到限制。
解决重组质粒不稳定性的另外一个根本性办法就是将外源基因插入到大肠杆菌的染色体中。
2 启动子
启动子是链上聚合酶的识别位点和结合位点, 外源基因表达的理想启动子是可以指
导高效转录, 保证目的基因高效表达的启动子。
3上游调控元件
位于中心启动子两侧的区域对转录效率起着重要的作用。在一些细菌的上, 位于‘端的上游一区域富含十系列, 可以增加聚合酶和亲和能力, 提高转录效益。
4 mRNA的稳定性
大肠杆菌的mRNA相当不稳定, 半存活时间在30秒到20分钟之间。与mRNA降解有关的酶是3‘ , 5‘ 外切和内切RnaseE，Npase，EDAD盒、RNA蜗牛酶Rh1B和糖分解烯醇化酶等。5‘端的不翻译结构的RNA二级结构（UTR）的稳定性与3’端rho非依赖性的末端结构终止结构都可以提高mRNA的稳定性, 但是稳定性大小有所差别。
5 翻译体系
由于在原核生物中, 转录和翻译相互偶联, 转录和翻译之间最适距离是个碱基, 如果少于个或大于个碱基就会显著影响基因的翻译效率。翻译起始区的能量对于基因的翻译有很大影响。
6外源蛋白在宿主细胞中的折叠
外源蛋白在大肠杆菌体内的表达常常会导致蛋白的错误折叠, 形成不溶性的包涵体。虽然包涵体的形成可以使蛋白质分离简单化, 但也会产生大量不具有生物活性的产物。传统的方法是采用降低发酵温度来减少蛋白质的聚集作用。
7 外源蛋白在宿主大肠杆菌细胞中的降解
外源蛋白在细胞中的降解可分为细胞质降解和周质中降解。大肠杆菌细胞可以将细胞内错误折叠和有害的蛋白质分解为氨基酸, 成为细胞内可用的氨基酸资源库而重新利用。因此将目的蛋白进行修饰, 转变为细胞内不溶的蛋白质, 如包涵体, 或选用带有温度敏感型突变的菌体作为宿主菌是普遍用来防止降解的办法。
8 融合蛋白
开始构建融合蛋白是为了便于蛋白的纯化和固定化, 以及在同一代谢途径中祸联不同酶的活性。后来发现, 融合蛋白伴随体配体可以大大提高转运蛋白的溶解性和融合蛋白在包涵体内的表达量, 融合蛋白之所以能够提高中间蛋白的折叠性, 减少被降解的机会, 是因为融合蛋白的伴随结构, 在脱离核糖体后, 可以很快形成自身的结构, 促进异构酶催化的下游折叠单元的异构化反应
不过融合蛋白的主要不足在于（1）让中间蛋白复性需要昂贵的蛋白酶（例如Xa因子和肠激酶），（2）裂解不完全, 会导致产物减少，（3）要获得有活性的蛋白, 需要很多步骤才能完成，（4）融合蛋白的可溶性难以保证。
9 宿主菌的培养控制
为了提高工程菌培养过程中质粒的稳定性, 工程菌的培养常分为两个阶段第一阶段, 先使菌体生长到一定密度第二阶段, 诱导外源基因的表达。
重组大肠杆菌培养方式是影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的另外一个外部因子。为了获得基因的高效率表达, 通常采用以下几种培养形式。（1）补料分批培养（2）连续培养(3) 透析培养.