分子生物学实验常见问题分析及对策-18

一、质粒提取常见问题分析
1．未提出质粒或质粒得率较低
可能存在的原因和解决方法：
1)质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。
2)菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。
3)碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液P1、P2和P3的用量。一般低拷贝的质粒5ml的菌液，高拷贝的质粒2-3ml小剂量提取。对低拷贝数质粒，提取时，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能有助于增加质粒提取量和质粒质量。
4)溶液使用不当：溶液P2、P3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。
5)吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB 或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。
6)质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。
7)乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。
8)洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。
9)洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris•Cl, pH 8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
10)洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大，回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。
11)洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置一分钟可达到较好的效果。
12)碱裂解时间过长:加入裂解液P2如SDS-NaOH后，时间不宜超过5min，因为此步骤的目的是使细胞内物质释放，蛋白质、染色体DNA和质粒DNA变性，时间过长，会导致加入中和裂解液P3如酸性醋酸钾后，仍无法使质粒DNA复性。导致提取失败。
13)大肠杆菌老化：请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2．质粒纯度不高：
可能存在的原因和解决方法：
1)混有蛋白：不要使用过多菌体。溶液P1、P2、P3处理并离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。
2)混有RNA ：RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液P3之后室温放置一段时间。如果溶液P1已保存6个月以上，请在溶液P1中添加RNase A。
3)混有基因组DNA：加入溶液P2和P3后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能把基因组DNA剪切成碎片从而混杂在质粒中。如果加入溶液P2后过于粘稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。
4)P3溶液加入时间过长：P3溶液加入后，放置时间不要太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。
5)含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5α和Top10。
6)裂解时间过长：加入溶液P2后裂解时间不应超过5分钟。
7)质粒的二聚体和多聚体形式：质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。
3．提取的质粒在跑胶时出现了条带 做了酶切后却看不到任何物质
   可能存在的原因和解决方法：
1)质粒浓度太低，纯度不高（纯度对酶切很重要）。
2)出现星号活性。
3)酶切时间过长，可能质粒降解过多：注意酶切体系及加酶量。
4．提质粒大都提的有三条带，是不是一条带就是好的呢
    这两种情况都可能出现，多数情况下你能看到三条带，但不是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果不小心在溶液P2加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100 kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
5．加完裂解液P2，P3之后动作太大有什么影响
    一般需要掌握好手法，不要给予瞬间的冲量（用手指轻轻弹几下，以松解难溶的团块也还是允许的），但是也要保证溶液混匀，至于上下颠倒的次数，依混匀为准。因为动作大小会影响DNA的断裂，不是需要太大的片断，有些断裂无所谓，不影响后边的操作。另外加入溶液P3动作过于剧烈，容易导致离心蛋白的效果不佳，也容易导致质粒终产物中的菌体基因组DNA污染的增大。

二、DNA电泳常见问题分析
1.DNA带模糊
可能存在的原因和解决方法：
1)电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，故需经常更换电泳缓冲液。
2)所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，同时核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
3)DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
4)DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5)有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
6)DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
7)DNA降解：应避免核酸酶污染。
2.不规则DNA带迁移
可能存在的原因和解决方法：
1)对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
2)电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。
3)DNA变性：用20mM NaCl缓冲液稀释DNA，电泳前勿加热。
3.带弱或无DNA带
可能存在的原因和解决方法：
1)DNA的上样量不够：增加DNA的上样量，但聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2)DNA降解：应避免DNA的核酸酶污染。
3)DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
4)对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254nm）的紫外光源。
4.DNA带缺失
可能存在的原因和解决方法：
1)小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
2)分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
3)DNA 变性：用20mM NaCl缓冲液稀释DNA，电泳前勿加热。
4)DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：改在脉冲凝胶电泳上分析。
5.重复性不好
可能存在的原因和解决方法：
1）凝胶制备的不规范：按要求严格操作。
2）凝胶放置过久：聚合时间不能太长或太短，分离胶不过一周，间隔胶当日用。
6.DNA电泳的MARKER带扭曲
可能存在的原因和解决方法：
1）配制胶时的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的：最好是同时配制。电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。
2）电泳时电压过高：可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm)，等条带出孔后再调电压。
3）上样时尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。

三、DNA回收常见问题分析
1.切胶的时候如何能切的准？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置？
    可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。
2.凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
    最关键的是切胶之后，溶胶的那一步。切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净，按照实验步骤，第一步应该是将胶充分的溶化。这以后步一定要做充分，保证凝胶已经完全溶解了。加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。
3.跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，能保存么？
   割下来的胶放在-20℃保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题，回收的效果也很好。
4.做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？
    有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
5.利用凝胶回收试剂盒DNA回收效率较低或者未回收到目的片断
可能存在的原因和解决方法：
1)胶块未完全溶解：可适当延长水浴时间，并增加上下颠倒次数辅助溶解。
2)胶块体积太大：应先将其切为小块，分多次回收。
3)电泳缓冲液pH太高：硅基质膜在高盐低pH结合DNA，如pH太高，应作适当调整。
4)漂洗液中未加入无水乙醇。
5)外缘DNA污染：在紫外灯下切下含待回收的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片。
6)改用去离子水洗脱，但是实验室所用纯水一般pH偏低，可利用NaOH适当提高其pH值，以增加洗脱得率。
7)不可以使用更小的洗脱体积（小于说明书提供的最小洗脱体积）进行洗脱以提高浓度，因为说明书上提供的最小洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积，若减少体积则不能将DNA完全洗脱下来。
6.DNA回收时，琼脂糖凝胶胶块不溶
可能存在的原因和解决方法：
1)琼脂糖质量不好。
2)含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水、干燥：切胶后应立即进行回收或保存在4或-20℃。
3)制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
四、外源质粒对大肠杆菌的转化常见问题分析
1.转化效率低
可能存在的原因和解决方法：
1)供试DNA样品不纯：应从DNA样品中进一步除去苯酚、蛋白、去污剂及乙醇。
2)供试DNA过量：每100μl的感受态细胞悬液加1-10ngDNA的溶液。DNA样品体积超过总体积的10%。
3)不完全的连接反应混合物：应该用最佳的连接反应物。在转化反应中，人工重组的质粒载体的转化效率要比超螺旋的质粒DNA的效率约低10倍。
4)连接反应混合物抑制转化：在与感受态细胞混合之前，用10mM Tris-HCl(PH7.5)和1mM EDTA稀释连接反应混合液5倍。
5)抗生素抗性的表达不足：①用S.O.C平板代替LB平板：实验表明，用S.O.C平板比用LB平板的转化效率高2一3倍；②若选用四环素抗性基因及启动子为选择标记，那么质粒转化的细胞至少应在非选择培养基中生长30分钟，以表达足够的抗性蛋白，使细胞在含四环素的平板上以最高效率形成菌落。③如用氨苄青霉素筛选，转化细胞必须稀释后再涂布。否则抗性菌落周围的一些菌落也会生长。用50—100ug/ml羧苄青霉素可减轻这一问题。
6)感受态细胞贮存的不适当：①不论是商品细胞还是实验室制备的，都应贮于-70℃处，但不要贮于液氮中；②减少解冻的次数。通常细胞样品以小体积包装，解冻后立即一次性使用，剩余的不再冷冻备用；③在干冰/乙醇浴中快速冷冻感受态细胞。
7)热冲击过程不适当：不同的商品细胞及实验室制备的感受态细胞对热冲击时间的要求略有不同，可根据具体情况进行摸索，转化反应所用的容器及细胞体积不同，最佳的热冲击条件也不同。根据预备实验，固定菌株小管型号、反应体积及热激的最适温度和时间。如改变了管子型号和反应体积，就应重新调整温度和时间。
2.重组质粒转化于大肠杆菌,接种到含有抗生素的平板培养基中,能生长，但接种到含同样抗生素的液体培养基中，无细菌生长
可能存在的原因和解决方法：
1)接到平板培养基上成功生长的菌种太少，长出的菌未必是转化进载体的大肠杆菌，可以做做牙签法质粒抽提，跑电泳看是否成功转化。
2)往液体培养基接种时量太少没接上：重新接种。
3.采用冻融转化法进行质粒转化试验，阳性对照长有单菌落，对照用质粒是别人的质粒，大小和我的质粒差不多，说明感受态是没问题，质粒是新提的，电泳检测有两条带，都很亮，质粒已经 PCR，酶切检测过了，均出带，做了3次，结果都是不长，平板也换过，是卡纳抗性，用别人的板也不长。
可能存在的原因和解决方法：
1)加大转化质粒的量。
2)质粒本身的问题，该质粒有可能编码产生对该细菌有致命损害的物质，因此有必要再查阅相关文献看看别人是怎么做的，以及用的什么菌种。