一、质粒提取常见问题分析与策略

1. 用试剂盒未提出质粒或质粒得率低有哪些原因？

1） 细菌老化

请凃布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2） 细菌培养物生长过度或不新鲜

不要于37℃培养超过16小时，分离质粒前长时间存放培养物是不利的。

3） 质粒拷贝数低

由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

4） 菌体中无质粒

    有些菌体本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应该接种单菌落。另外检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

5） 菌体过量，碱裂解不充分

    取样时菌液过多，导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍增加溶液悬浮液、裂解液、中和液的用量（应保持1：1：1.4比例）。

6） 溶液使用不当

   溶液裂解液、中和液在温度较低时容易出现盐析，如出现，应将其放入37℃水浴至完全溶解、澄清，方可使用。

7） 质粒未全部溶解（尤其质粒较大时）

洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8） 乙醇残留

洗涤液Ⅱ洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后，再加入洗脱液洗脱回收。

9） 洗脱液加入位置不正确

洗脱液应加入吸附柱中膜的中央以确保洗脱液完全覆盖吸附膜的表面达到最大洗脱效率。

10） 洗脱效率：

洗脱效率与洗脱液PH值、洗脱液用量、洗脱次数、加入洗脱液后的静置时间和是否预热等因素有关。PH7.0－8.5之间，洗脱液用量不得小于50μl，重复洗脱2-3次，增加室温静置时间及65℃水浴预热可以有效提高得率30%。

2. 试剂盒提取质粒纯度不高，如何解决？

1） 有蛋白质污染

应在加入去蛋白液后，以足够高的转速离心，使沉淀紧密，并小心地吸取上清液，避免吸入沉淀。另外，不要使用过多菌体。经悬浮液、裂解液、中和液处理，离心后溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白悬浮物可再次离心去除后再进行下一步骤。

2） 有RNA 污染

说明RNaseA处理不彻底，请减少菌体用量或加入悬浮液之后，振荡充分混匀室温放置一段时间。如果悬浮液已保存6个月以上，请在悬浮液中添加RNaseA至终浓度100μg/ml。

3） 混有基因组DNA

   加入裂解液、中和液后应温和混匀，如果剧烈振荡，可能会导致基因组DNA断裂成小碎片从而混杂在质粒中。如果加入裂解液后过于黏稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。另细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，培养时间不要超过16小时。

4）裂解液加入时间过长

     裂解液加入溶液后，放置时间不宜太长，否则有可能会产生小片段DNA污染。

5） 含大量核酸酶的宿主菌

      宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取过程中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，如DH5а和Top10。

 6） 质粒的二聚体和多聚体形式

      质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出多条条带，单酶切处理后可变成单一条带。

3. 在琼脂糖凝胶上点样时，为什么质粒漂出点样孔？

乙醇没有完全从柱子上去除。洗涤液2洗涤后应离心并静置数分钟尽量去除残留乙醇后，再加入洗脱液洗脱回收。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？

　　用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

　　在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na⁺中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

　　在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca^2＋产生Ca₃(PO₄)₂沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH⁺/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

7．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

　　酚与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

　　作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

7．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？

　　在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊醇为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

9． 为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

　　因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

　　保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

10. 细菌离心加入溶液I涡旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？

1） 很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。
2） 质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。
3） 判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。
4） 菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂质。

11. 为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？
1） 可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO₂失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。  

2） 可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下。
3） 可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的RNA酶。
4） 如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等)，然后使用一般的发放。
5） 可能质粒随乙醇一起倒掉了。

12. 加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？
1） 问题可能是发生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？

2） 可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。
3） 可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。

13. 加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？
       乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。

14. 使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开?
1） 确认酶的有效性。
2） 平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。
3） 是否不小心吸入了痕量的酚。
4） 乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。
5） 乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。

15. 提取质粒中RNA没有去除 ？

可能是RNase失效或效率不高。

1） 更换RNase A，并保证其储存条件是正确的
2） 手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤 ，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。

16. 提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？
1） 质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。

2） 当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。

3） 可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切 。
4） NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。

17. 用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA 15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？

1） 溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。
2） 确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚/氯仿重新抽提一下。

3） 也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。
4） 没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染；
5） 在没有进行酶切时，把所提的质粒跑一下核酸电泳看看，如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带，这样可以先排除核酸提取的问题。若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。
18. 培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？

如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。