1 PCR反应

1.1假阴性，不出现扩增条带

可能原因：

（1）模板：①模板中含有杂蛋白质；②模板中含有Taq酶抑制剂；③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白；④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚，模板本身拷贝数低；⑤模板核酸变性不彻底。

对策：纯化模板；配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改；如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA。

（2）酶失活

对策：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

（3）引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，

对策：①选定一个好的引物合成单位；②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效；④引物设计不合理，如引物长度不够引物之间形成二聚体等，需重新设计引物。

（4）Mg²⁺浓度：Mg²⁺离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

对策：调整Mg²⁺浓度，从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。

（5） 反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

对策：优化PCR温度，有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度。

（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

1.2假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

可能原因：

（1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

对策：需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

对策：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污 染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。

对策：可用巢式PCR方法来减轻或消除。

1.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：

（1）引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。（2）Mg²⁺离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。（3）酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

对策：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg²⁺浓度。

1.4 出现片状拖带或涂抹带

可能原因：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多。

对策：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg²⁺浓度。④增加模板量，减少循环次数。

2 RT-PCR反应

2.1 在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物

可能原因：

（1）RNA被降解

对策：①在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA，使用良好的无污染技术分离RNA；②在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；③如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。

（2）RNA中包含逆转录抑制剂

对策：通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。（逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，spermidine，甲酰胺和胍盐。）将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。

（3）多糖同RNA共沉淀 

对策：使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。

（4）用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火

对策：①确定退火温度以适合引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。②对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体。③确定GSP是反义序列。

（5）起始RNA量不够

对策：增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。

（6）RNA模板二级结构太多

对策：①将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火。②提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。不要在高于37℃时使用M-MLV。③如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。

（7）引物或模板对残余的RNA模板敏感  对策：在PCR前用RNaseH处理。

（8）靶序列在分析的组织中不表达  对策：尝试其他靶序列或组织

（9）PCR没有起作用

对策：对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物。

2.2 污染造成假阳性

可能原因：
（1）样品间的交叉污染

对策：①收集样品的容器最好使用一次性的，如重复使用，应在使用前应于180℃的高温下干烤6小时或更长时间；②样品存放时要密封严实，以防外溢造成相互间的交叉污染；③样品在提取过程中离心管及吸样枪头最好使用一次性的，以免不同实验样品间相互污染；④由于吸样枪污染会导致样品间的污染，也是一个值得注意的问题，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取时要十分小心，吸时要慢，吸取尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染；⑤同时要注意操作时不要剧烈地摇动反应管，开盖时也容易造成气溶胶污染。每次实验完毕都要及时清理实验台面，用0.5%次氯酸钠消毒后再打开紫外灯照射半小时。

（2）RT-PCR本身使用的试剂污染在试剂配制过程中，由于加样枪、容器及其它溶液被污染。

对策：所有试剂都应尽量小量分装，以减少重复加样次数，避免污染机会，另外RT-PCR试剂应尽可能密封好分类存放。每次操作完毕后同样要进行台面消毒和紫外线照射消毒。

（3）扩增产物的污染，极微量的扩增产物污染就可造成假阳性。

对策；每次实验完后，扩增产物都要及时密封后处理。设阳性对照 。

（4）操作人员污染：只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解，从而影响结果的准确性，RNA酶可存在操作人员手汗、唾液中，也可灰尘中，一旦器械、玻璃制品、塑料制品受到污染，容易造成实验失败。

对策；操作人员应戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置PCR操作专用实验室，所用实验用具应为专用，并合理分隔实验室，将样品的提取、配制RT-PCR反应液、PCR循环扩增等步骤分室进行，实验前应将实验室及实验人员工作服用紫外线或臭氧消毒以破坏残留的DNA或RNA。

2.3在无反转录酶的情况下，对照RNA获得扩增结果

可能原因；

（1）对照RNA中含有痕量DNA。

对策：第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。

（2）有可能是引物二聚体的条带。

2.4扩增产物滞留在加样孔中

可能原因：由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。

对策：将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。