实验三   肠道菌的分离培养与鉴定

目的要求：

1．熟悉选择和鉴别培养基的原理；

2．了解大肠杆菌的主要培养特性；

   3．熟悉大肠杆菌和沙门氏菌的常规鉴定方法；

基本原理

肠道菌大多为革兰氏阴性小杆菌，采用一般染色和分离培养难以鉴别，故须采用鉴别和生化试验培养方能鉴定。不同种类的肠道菌，产生的酶类和活性不同，在代谢过程中，产生分解产物和合成产物各不相同，利用细菌的生化特性，以生物化学的方法来鉴别细菌称为生化试验。

细菌分离培养和移植应注意下列事项：

1．选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长的培养基以及所需的气体与培养温度(病原菌一般为37℃)等。

2．严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰，接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精灯火焰灭菌。

3．防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，否则会将细菌烫死；另外，还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。

4．纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。

一、肠道菌的分离培养法

(一)需氧菌分离培养法

1．平板划线法  此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散，以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。

术式

右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸人酒精灯火焰中烧至通红，再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面与水平面成45°角，接种环同培养基平面也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。

方法

接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实5-2中所示的几种划线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线，以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材料名称及日期，倒转置37℃恒温箱中培养。

一．鉴别（或选择）培养

（一）麦康凯琼脂培养基分离培养

1．原理   在培养基中含有胆盐，可抑制大部分革兰氏阳性菌（Gt）的生长，培养基含乳糖，大肠杆菌能分解乳糖，使pH下降（而中性红指示剂5.5--7.5，红--黄）形成红色菌落，而沙门氏菌和志贺氏菌，不能分解乳糖，菌落小而无色。

2．方法

将需要鉴别的肠道菌（大肠杆菌和沙门氏菌）或含肠道菌的病料，在康凯琼脂培养基上划线分离，37℃培养24h观察。使之得到单个菌落。

3．结果  大肠杆菌在此培养基上形成红色菌落，沙门氏菌形成无色或浅黄色菌落。

（二）SS琼脂培养基分离培养

1．原理  此培养以中性红作批示剂，其中还有胆盐硫代硫酸钠，构椽酸钠，煌绿等等抑制G+的生长，对大肠杆菌了有一定的抑制作用，只有少数生长。培养基中含有乳糖，在大肠杆菌能分解乳糖，产酸，指示剂显红色（5.0-7.4  红—黄），故大肠杆菌呈红色菌落，而沙门氏菌不能分解乳糖，没能使培养基变酸呈黄色菌落。

2．方法：将待检肠道菌和病料在SS琼脂培养基上划线分离置37℃培养24h观察。

3．结果：大肠杆菌呈红色菌落，沙门氏菌呈浅黄色菌落。

（三）伊红美兰琼脂培养基分离培养

1．原理   因大肠杆菌分解乳糖产酸，而伊红美兰在酸性环境中二者结合成紫色或紫黑色化合物，故大肠杆菌呈紫红色或紫黑色化合物，并带有金属光泽的菌落。而沙门氏菌不能分解乳糖，没能使培养基变酸呈粉红色菌落。

2．方法：将待检肠道菌在伊红美兰琼脂培养基上划线分离37℃培养24h观察。

   3．结果：大肠杆菌呈紫红色或紫黑色并带有金属光泽的菌落而沙门氏菌呈粉红色菌落。

伊红美兰的结果

（四）双糖铁（或三糖铁）琼脂培养基    分离培养

1．原理：在培养基中含乳糖、葡萄糖（或蔗糖），在底部，大肠杆菌能分解全部糖。底部游离氧较小，发酵不能达到最后产物，因此，积累的酸类较多，故呈黄色。在上部（斜面），虽然有充足的氧，但积累的酸性产物仍然较多，故为黄色。

而沙门菌在发酵葡萄糖时，因底部游离氧较少，发酵不能达到最后产物，积累的酸类较多，故底部呈黄色。而上部，由于游离的氧气充足，发酵作用进行得较完全，能形成最后产物（CO2­和H2O）这样积累的酸类较少，指示剂酚红，不变色，若产生H2S，能形成硫化铁，而使培养基呈黑色。

三糖铁琼脂培养基的结果

2．方法：将待检查在斜面上划线，在深层穿刺，37℃培养24-48h观察。

3．结果：大肠杆菌在斜面和深层均为红色，而沙门氏菌在斜面为红色，在深层为黄色，若产生H2S有黑色的沉淀。

二．生化试验

1．糖发酵试验

1）原理  各种细菌具有不同的酶，有的细菌能分解某些糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只产酸不产气，，有的细菌则不能分解。借此特点，可以鉴别细菌。

2．方法  将需要鉴别的细菌纯培养物，分别接种在各种含指示剂的糖发酵管内，将发酵管倒置于37℃温箱中培养，培养的时间随试验的要求及细菌分解能力而定，可按各类细菌鉴定方法所规定的时间进行。

3．结果  产酸产气时，可使培养基的指示剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡；只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变，不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌分解乳糖产酸产气；用“㈩”表示，金黄色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气，用“+”表示；马流产沙门氏杆菌不能分解乳糖，用“一”表示。

V--P试验)

1）原理  某些细菌(如产气杆菌、阴沟杆菌：等)，能分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇。加KOH溶液后，在碱性环境下，乙酰甲基甲醇被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含胍基发生反应，生成红色的化合物。在培养基中加入少量含胍基的化合物(如叽酸或肌酐等)，可以加速这个反应。在加KOH前，先加入a-萘酚，也可提高试验的敏感性。

2）方法  将被检菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养管中，经37℃培养48h。加入甲液、乙液各一滴，充分摇动培养管，观察结果。

3）结果  如立即或于数分钟内出现橙红色或红色反应者为阳性。不变色者，将培养管放37℃中4h后再进行观察，若仍不变色或仅呈淡褐色者为阴性。产气杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

3．甲基红试验(MR试验)

1）原理  某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸、丙酮酸再被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红指示剂变色范围pH4.4(红色)一6.2(黄色)。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养基的酸度仍在pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色为阴性。

2）方法  将细菌接种在葡萄糖蛋白胨水中，在37C培养3～4d，加入MR试剂1～2滴，观察反应结果。

3）结果  红色反应为阳性，无色反应为阴性。例如，大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性。

4．靛基质(吲哚)试验

1）原理  某些细菌(如大肠杆菌、变形杆菌等)能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质，若再与试剂对二甲基氨基苯甲醛作用后，形成玫瑰红色靛基质。

2）方法  将被检细菌接种于胰蛋白胨水中，于37℃培养2—3d，沿试管壁滴加上述试剂于培养基液面上，即可观察。

3）结果  在培养物与试剂的接触处出现玫瑰红色为阳性反应；无红色，仍为淡黄色为阴性。例如，大肠杆菌为阳性，沙门氏菌为阴性。

5．枸橼酸盐利用试验

1）原理  枸橼酸盐培养基中的枸橼酸钠是惟一的碳源。有的细菌(如产气杆菌等)可利用枸橼酸盐作碳源，能在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐而使培养基变为碱性。此培养基中的溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，表示枸橼酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，则细菌不生长，培养基仍保持棕色，表示枸橼酸盐利用试验阴性。

2）方法  将细菌接种在枸橼酸盐培养基斜面上，经37℃培养2—4d后，观察结果。

3）结果  长出菌落，培养基变深蓝色为阳性；细菌不生长，培养基仍为原来的棕色为阴性。例如，沙门氏菌为阳性，大肠杆菌为阴性。

6．硫化氢试验

1）原理  某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸等，生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。

2）方法  将细菌接种于硫化氢试验培养基中，37℃恒温箱中培养18-24h，观察结果。

3）结果  培养基变黑为阳性，不产生黑色为阴性。例如，沙门氏菌多数菌株为阳性，大肠杆菌为阴性。

7．硝酸盐还原试验

1）原理  有些细菌能将培养基中的硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐与对位氨基苯磺酸起作用后，再与a-萘胺反应，生成红色偶氮化合物。由此证明细菌有还原硝酸盐为亚硝酸盐的能力。

2）方法  将被检细菌接种于硝酸钠蛋白胨培养基内，37℃培养24—96h加第一液0．1ml，第二液0．1ml，观察反应结果。

3）结果  培养基呈红色或紫红色为阳性，不变色为阴性。需要注意的是，繁殖速度快，还原硝酸盐能力强的肠杆菌科细菌，常可将亚硝酸盐进而分解成氨和氮，造成假阴性，故应每天加试剂检测。

8．DNA酶试验

1）原理   某些革兰氏阳性菌（如葡萄菌、链球菌等）能产生。

胞外DNA酶，可使培养基中的DNA长链长解，成为由同个单核苷酸组成的寡核酸链，DNA水解后的核苷酸和寡核苷酸可溶于盐酸，而未解的长链DNA则不溶于酸而沉淀。

2）操作方法  将被仔细菌作点状接种于含DNA琼脂平板上，于37℃培养24-48h，加入1N的HCI覆盖平板表面。

3）结果   分泌DNA酶的细菌在菌落周围出现透明环，不产生DNA酶的菌落不出现透明环。例如，肠杆菌科中的变形杆菌、沙雷氏菌、某些葡萄球菌产生DNA酶，可用本试验鉴别。

三、肠道菌鉴别培养及生化试验结果

大肠杆菌     沙门氏菌    产气杆菌      变形杆菌

麦康凯                红色菌落       浅黄色        红色菌落       浅黄色

SS培养基           红色菌落          浅黄色      红色菌落      粉红色

伊红美兰             黑色带金      粉红色           红色          浅黄色

                           属光泽

三糖铁            斜面 深层       斜面为红色     黄色       黄色

                        均为黄色        深层为黄色          

四、生化试验结果

大肠杆菌 沙门氏菌  产气杆菌 变形杆菌

葡萄糖          +             +                +              +

乳糖               -              -                 -               -

麦芽糖           +             +                +            +/-

甘露醇           +             +                +              -

蔗糖               +/d         d/-               +             +

枸橼酸盐        -            d                  +             +

碳化氢             -            +/-              +              -

明胶                 -            +/-               -              -

靛基质             +             -                -              -/+

V．P                +             -                +              -

M．R               +             -                -              +

[实验材料]

实验材料

1． 待检验的细菌   须用新鲜的纯培养物

2． 各种生化试验培养基 （见附一）

   3． 各种生化试验的试剂 （见附一）