无菌操作步骤及注意事项

1、培养基种类：液体和固体两大类。加凝固剂（常用琼脂）的培养基为固体培养基，不加凝固剂的为液体培养基。不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方，尽管培养基的配方各不相同，有些培养基还要调pH值，但是其基本成分都包括水、碳源、氮源和无机盐。碳源主要是指各种糖类如葡萄糖、白糖、蔗糖、淀粉等，氮源常用的是蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等等，还有各种铵盐如硫酸铵、尿素等等。无机盐一般是指一些微量元素如硫酸亚铁等。

2、培养基灭菌方法：培养基灭菌方法常用的有湿热灭菌和煮沸灭菌。煮沸灭菌在电磁炉或者微波炉内进行煮沸即可；湿热灭菌方法是用高压灭菌锅进行灭菌，灭菌温度是121℃，时间为20分钟，灭菌锅如果是全自动的就不需要手动放冷空气，否则等灭菌锅压力升至0.05时要手动放掉锅内冷空气。灭菌完毕后，等压力降至“0”才能打开灭菌锅盖取出培养基。

3、检查培养基灭菌是否合格：将灭菌好的培养基在恒温培养箱中培养24小时后看有无菌落生长（液体培养基是否变浑浊），如果无菌落生长，液体培养基不变浑浊说明培养基的灭菌是成功的，否则灭菌不合格。

4、玻璃器皿灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌。干热灭菌方法：用报纸或者牛皮纸包好，放进高温干热烤箱160度烘烤2小时，湿热灭菌是用牛皮纸包起来放在高压锅中进行高压灭菌，温度时间同上。

5、接种时首先将要接种的平板、试管、三角瓶等放进超净工作台，打开超净工作台紫外线灯照射15-20分钟杀菌后（注意开通风），再等10-15分钟后开日光灯进行操作，首先把菌种拿进超净工作台，然后用酒精棉球擦拭手及接种工具，擦拭完毕后将接种工具在酒精灯火焰上烧灼发红后再在接种器具旁边冷却一下再接种，操作时尽量靠近酒精灯火焰旁边。接种的平板、试管、三角瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。接种完毕为了避免污染环境和工作台，将接种器具在酒精灯火焰烧灼，工作台擦拭干净。