染色体核型分析

通过对植物组织的取材、预处理、解离、染色、压片等制片步骤的学习，掌握植物制片技术，奠定细胞遗传学的研究技术；分析植物细胞有丝分裂中期染色体数目、大小、着丝粒位置和随体等形态特征，学习染色体组型分析的方法，为物种起源和进化提供依据，为遗传育种研究提供细胞学证据。

有丝分裂是植物细胞分裂的主要方式。通过有丝分裂增加细胞的数量而使植物有机体不断生长。在有丝分裂过程中，核内染色体准确地复制，并有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去，使子细胞和母细胞的遗传组成一样，保证了植物细胞的遗传性状的一致。各种生长旺盛的植物组织中，如根尖组织、茎尖组织、居间分生组织、愈伤组织等，常进行着剧烈的细胞有丝分裂。在细胞分裂的适当（分裂旺盛期）时候取材，进行预处理，固定、解离、染色和涂抹压片等方法，使细胞、染色体分散，便于在显微镜下观察染色体的形态特征和变化特点及进行染色体计数。

各种生物染色体的形态，结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成叫染色体组型。染色体组型分析也称核型分析。通过一定的方法制得染色体有丝分裂的玻片标本，经显微照相，冲洗放大等步骤获得染色体照片。从染色体玻片标本和染色体照片的对比分析，进行染色体分组，并对组内各染色体的长度，着丝点位置，臂比和随体有无等形态特征进行观测和描述，从而阐明生物的染色体组成，确定其染色体组型，这种过程称为染色体组型分析。染色体组型分析在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。

 

蚕豆（Vicia faba， 2n=12）干种子

 

多媒体显微演示系统、显微照相系统、培养箱、分析天平、水浴锅、酒精灯、剪刀、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、滤纸、铅笔、标签纸、棕色瓶、相片冲洗放大整套设备、目镜测微尺、镜台测微尺、4^＃放大纸、135黑白胶卷、计算器、透明尺、坐标纸、胶水等。

秋水仙碱、8－羟基喹啉、苏木精、水合三氯乙醛、铁矾、无水酒精、冰醋酸、1N盐酸、50％丙酸米吐尔、无水亚硫酸钠、几奴尼（对苯二酚）、无水碳酸钠、溴化钾、硫代硫酸钠、硼酸、钾矾、28％醋酸等。

（一）材料准备：

1.蚕豆根尖：选取新鲜无病斑的蚕豆干种子，经日晒后，放在烧杯内，室温下清水浸泡一昼夜。种子吸水膨胀后，放在搪瓷盘上20℃左右保湿培养（双层纱布覆盖），待根长1~2cm时，剪下根尖备用。

（二）预处理

为了获得较多中期分裂相的细胞，同时使染色体缩短和分散，可对根尖进行预处理，处理方法如下：

1.0.05％~0.2％的秋水仙碱水溶液处理2~4小时。

2.0.002M的8~羟基喹啉溶液处理3~4小时。

3.根尖浸在蒸馏水中于在1~4℃低温下处理24小时。

（三）固定：

用蒸馏水洗净材料，再用卡诺氏（冰醋酸:无水酒精=1:3）固定液（用量应为材料体积的15倍以上）室温下固定30~60分钟。经90％酒精→80％酒精→70％酒精（各半小时）浸泡进行转换，最后置于70％酒精内放入0~4℃冰箱保存。

（四）解离：

根尖、茎尖等体细胞需经处理，除去细胞间的果胶层，并使细胞壁软化，才便于压片。这种处理过程称为解离，解离时间的长短依植物材料和解离液的不同而不同。时间短细胞不易压散，时间过长，细胞被压破，且影响染色效果。

方法：固定的材料（蚕豆根尖）用蒸馏水冲洗2遍，然后放入预热的60℃的1N盐酸中，60℃恒温处理5分钟左右，倒去盐酸，用蒸馏水冲洗3遍后，将材料浸泡在蒸馏水中2小时。

（五）染色液和制片

1.      染色液：

（1）丙酸－铁矾苏木精

　 贮存组：A液：苏木精2克，溶于100ml 50％丙酸，

　　　　　 B液：铁钾矾0。5克溶于100ml 50％丙酸。

　 染色液：A液和B液等量混合，每5ml的A液和B液的混合液中加入2克水合三氯乙醛，充分溶解摇匀，存放一天后使用。

2. 制片：

选取已处理过的根尖一枚，放在干净载玻片中央，除去非分生组织的部分，并吸去多余水分。另取一张干净载玻片，呈十字形交*盖在有根尖的载玻片上，用大拇指按压在载玻片的中央，使根尖压成一簿层，然后将两载玻片分开，各滴一小滴上述染色液进行染色，稍等片刻，取一盖玻片，盖玻片一边*在离材料不远的载玻片上，左手握镊子顶着盖玻片，右手握解剖针托住盖玻片徐徐放下，若染色液不能布满盖玻片时，可在盖玻片边缘稍加染色液，然后用一张大小合适的滤纸覆盖在盖玻片上，一手固定盖玻片，另一手持铅笔橡皮头，对准材料轻敲，使根尖细胞分散均匀。

（六）显微观察

制备好的细胞学片子，置于显微镜的载物台上，先用低倍镜（10×10）调焦观察，寻找具有分裂相的细胞后，再转换到高倍镜（10×40）下观察。

（七）测量

选出符合染色体组型分析要求的细胞，这些细胞是处于有丝分裂中期，染色体分散良好，没有重叠，数目完整，随体和着丝点明显，没有断裂，着色鲜明，形态清晰，且各条染色体处于同一平面上。

选择染色体较平直的一条或几条，用目微尺（目镜测微尺）测量其长度。

（八）显微照相、冲洗和放大

将在显微镜下选定的符合要求的细胞进行显微照相，然后冲洗，选取图像清晰的底片，放大、洗印出染色体形态清晰的照片。在显微照相的同时，对镜台测微尺进行同样倍数拍摄，放大，然后根据照片上的实际长度，计算放大倍数。

（九）测量和计算

1.测量：在放大的照片上用透明尺准确地量出各条染色体的总长度和每条染色体两臂的长度（分别量到着丝点的中部）。随体的长度可计入或不计入染色体长度之内，应注明。染色体弯曲不能用直尺测量时，可先用细线量取染色体相等的长度，再用尺量出细线的相应长度。

放大照片上某染色体的照相长度（μ）   目镜测微尺测定的实际长度（μ）

2. 计算

（1）放大倍数＝

放大相片的台测微尺长度（mm）   台测微尺实际长度（μ）

    　    

或＝　　　

 

某染色体照片长度（μ）   放大倍数

 

（2）绝对长度＝

 

　　　　　

（3）相对长度：（取小数点后两位数）

某染色体绝对长度                              ×100％                             1/2全部染色体的总长度

 

　　　　　　　

 

（4）臂比（取小数点后两位数）

 

长臂的长度 　　　　　　　　　 短臂的长度

　　　　　　　

 

（十）染色体形态测量数据表

染色 体序 号	放大相片长度（mm）			绝对长度（μm）			相对 长度	臂比	染色体类型	备注
	长臂	短臂	全长	长臂	短臂	全长

（十一）剪贴和配对

将放大照片上的各条染色体剪下，根据目测和染色体的相对长度、臂比、着丝粒位置、次缢痕的有无和位置、随体的有无和形态大小等特征，进行同源染色体配对。

（十二）排列和粘贴

将配对好的染色体按照由大到小的顺序依次排列起来。排列时把各对染色体的着丝粒排在一条直线上，并且使短臂在上，长臂在下。等长的染色体，把短臂较长的染色体排在前面。随体染色体排在最后，性染色体和额外染色体单独排列。

已排好的同源染色体按染色体编号先后顺序粘贴在绘图纸上，粘贴时着丝粒要处在同一直线上。

（十三）分类

根据着丝点的位置，确定染色体的形态类型，臂比是反映着丝点在染色体上的位置。

具随体染色体（sat）用*标出。

（十四）翻拍和绘图

将剪贴排列的染色体组型图进行翻拍，并用座标纸绘制成染色体模式图。

1. 制作细胞有丝分裂各时期图象片子1－2张

2.描绘所观察到的细胞有丝分裂过程中各时期的图象，并简要说明染色体的行为特征。

3. 提交植物染色体组型剪贴图

4. 提交植物染色体组型的模式图

5.提交染色体形态测量数据

6.简述本实验的染色体组型结果，核型公式。