植物细胞脱去细胞壁即可获得原生质体。1960年英国植物生理学家Cocking首次用纤维素酶降解番茄幼苗根尖细胞得到原生质体，从而开创了用酶解法分离植物原生质体的新时期。从理论上说，只要用适当的酶处理，就能从任何植物的任何活的组织或其培养的细胞系都可以分离得到原生质体。但是，要得到产量高、活性强、能进行分裂、杂交后能形成愈伤组织或胚状体，最后再生成完整植株的原生质体，则受许多因素影响。就影响原生质体分离时的数量和质量来说，除了上述提到的取材以外，还要考虑到酶的种类及其组合、酶液的渗透压、原生质膜的稳定剂、酶解时间与温度、分离和纯化的方法等。用于植物原生质体游离的酶组成主要是纤维素酶和果胶酶，有时再加入半纤维素酶。酶液浓度一般为纤维素酶1% ~ 2%，果胶酶0.5% ~ 1%。浓度过低，去壁率低，影响原生质体分裂；浓度高则破裂多，产率低，褐化严重，分裂频率低。酶液pH 5.1 ~ 5.8，酶解时间几小时至几十小时不等，以获得足以满足所需原生质体的数量为准。但是，酶解时间过长会造成先前已经游离的原生质体解体、破碎或非目的融合，所以，一般不超过24 h。酶解温度以45 ~ 50℃最佳，但对植物细胞来说太高，一般都在25℃左右酶解。这有利于保持原生质体的活力。酶解处理通常静置在黑暗中进行，偶尔用手轻轻摇晃即可。对于愈伤组织、悬浮细胞等难游离原生质体的材料，可置于低速（30 ~ 50 rpm）的摇床上促进酶解。

植物细胞除去细胞壁后，如果酶液中的渗透压和细胞内的渗透压不平衡，原生质体有可能涨破或收缩。因此，在酶液、洗液和培养液中，应当加入渗透压的稳定剂，使得其渗透压大致与原生质体内的相同或相近。广泛使用的调节剂有甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖或麦芽糖，其浓度在0.4 ~ 0.6 mol·L-1，都具有相同的稳定渗透压的作用。加入CaCl2、KH2PO4、MES、葡聚糖硫酸钾等都可以提高原生质膜的稳定性。

植物材料经酶解后，需要将原生质体与组织残渣，以及酶液分开，使原生质体纯化，才能进行融合和培养。因植物种类和采用的渗透压稳定剂不同，纯化的方法也有所不同。最常用的方法是过滤和离心的相结合的方法。通常用40 ~ 100 µm尼龙网或镍丝网过滤，收集滤液并离心（500 ~ 800 rpm）3 ~ 5 min，取上清。转到洗液（除不含酶液外，其他成分与酶液相同）中，再次离心，取上清，如此重复3次，即可获得纯净的原生质体。