试验要求：将重组质粒pEGFP-C3-SNCA（A53T A30P WT）以及空载体质粒PEGFP-C3转染至PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤），并筛选出稳定转染的细胞株。

技术步骤：

1、质粒准备

复苏－20℃保存的经测序确认的转染有相应重组真核表达载体pEGFP-C3-SNCA的E.coliDH5α菌种，将pEGFP-C3-SNCA菌以1：100接种至10ml含0.5%卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，次日取出后用Roche公司的Plasmid mini kit试剂盒小量制备质粒DNA。具体步骤如下：取过夜培养的菌液4ml，9000rpm离心30s，去上清，加入SolutionⅠ 250μl重悬菌体，加入SolutionⅡ 250μl，轻轻混匀，室温下静置5min，加入SolutionⅢ 350μl，轻轻混匀，置冰上5min后以最大转速离心10min，将spin column放在收集管上，吸取离心后的上清移到spin column中，最大转速离心30s，弃掉收集管中的液体，将spin column重新放在收集管上，加入Solution Ⅳ500μl到spin column中，最大转速离心1min，弃掉收集管中的液体，将spin column重新放在收集管上，加入Solution Ⅴ700μl到spin column中，最大转速离心30s，弃掉收集管中的液体，再一次以最大转速离心30s，弃掉收集管中的液体，将spin column放在一个干净的无菌EP管中，加入 100μl过0.22μm滤膜的Elution buffer到spin column中，室温静置5min后最大转速离心1min，EP管中收集到的液体即为纯化的质粒DNA，将其用紫外分光光度计定量后置于-20℃备用。

2、PC12细胞培养

将复苏的PC12细胞用10%小牛血清的RPMI1640培养基培养，5%CO₂   37℃培养，待用。

3、细胞转染

（1）转染前一天铺细胞，转染时细胞量为50%----70%

（2）用转染总体积1/2量的无血清培养基稀释质粒DNA

（3）用转染总体积1/2量的无血清培养基稀释脂质体

（4）将DNA快速加入到脂质体中

（5）室温放置10-----45分钟

（6）弃细胞上清，加入DNA-脂质体混合物，37℃  3-5小时

（7）之后，加入有血清培养基，培养过夜

（8） 24小时后，正常10%小牛血清培养基培养，观察检测

转染后24小时，在显微镜下观察细胞可见荧光，但数量不多。48小时后荧光有所加强，数量增多，亮度也有所增强。有荧光的细胞占总细胞的30%左右，转染效率不高。随后在48h-72h之间开始筛选，用含500ug/mlG418的10%小牛血清RPMI1640培养基进行筛选，加入含有G418的培养基12小时后细胞开始有死亡。48小时，细胞死亡增多，在显微镜下观察，继续用500ug/ml G418的培养基筛选。一周后可见成团细胞生长出来，换用含200ug/ml G418的培养基维持培养。等细胞生长稳定后进行检测。检测方法有RT-PCR 和Western blot两种方法检测α-synuclein基因的表达水平。

结果：

转染图片