The rational for RNA interfering technology

    目前，RNAi技术已经成为研究热点，该方法主要采用向生物体内导入dsRNA（double chain small RNA, dsRNA），从而关闭特殊基因的表达。该方法可以用于基因功能的研究、快速地建立动物模型、药物筛选等很多方面。

        2006年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰机制。

    1990年，曾有科学家给矮牵牛花插入一种催生红色素的基因，希望能够让花朵更鲜艳。但意想不到的事发生了：矮牵牛花完全褪色，花瓣变成了白色！科学界对此感到极度困惑。类似的谜团直到1998年美国科学家安德鲁·法尔和克雷格·梅洛发现了RNA干扰机制才得到科学地解释。根据法尔和梅洛的发现，科学家在矮牵牛花实验中观察到的奇怪现象，其实是生物体内某种特定基因“沉默”了。导致基因“沉默”的机制就是RNA干扰机制。

    此前，RNA分子只是被当作从DNA到蛋白质的“中间人”、将遗传信息从“蓝图”传到“工人”手中的“信使”。但法尔和梅洛的研究让人们认识到，RNA的作用不可小视，它可以使特定基因开启、关闭、更活跃或更不积极，从而影响生物的生长和发育等。“他们的发现揭示了控制遗传信息流动的自然机制。这开启了一个新的研究领域” 。

     在RNAi的初始阶段，dsRNA(一般大于30bp) 通过转染等方式进入细胞后，在Dicer酶的作用下被酶解成小RNA(small interfering RNAs, siRNA), siRNA的长度一般在21~25nt, 并且在3’ 端有2个突出的不配对碱基。该剪切过程是依赖ATP的，并且Dicer酶属于RNaseⅢ家族中一种对dsRNA具有特异性的一种核苷酸。siRNA是一种短片断双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA, 这个过程就是RNA干扰途径（RNA interference pathway）。

    在RNAi的活化阶段，上述剪切产生的siRNA 与核酸酶复合物组成RNA诱导复合物（RNA-induced silencing complexes, RISC）, RISC的活化需要ATP与siRNA的共同作用。活化后的RISC复合物中的反义链与目的基因转录出的mRNA 结合后，激活RNA诱导复合物中的核酸酶，降解目的mRNA。在降解的过程中，对mRNA进行酶解的RNase与Dicer是不同的，而且降解的位置大致位于离mRNA 3’ 端12 个碱基附近。

在最后的酶解mRNA过程中，反义链siRNA 与mRNA之间的配对起了重要的引导作用，最终引导核酸酶降解mRNA,完成对特定基因的干扰。一般而言，反义链siRNA 与mRNA 之间一个碱基的错配就可以使干扰效率大大降低。可见在进行RNAi 的研究中获得高效率的siRNA是很重要的，一般针对一个特定基因，需要设计、合成3~4组siRNA序列。

　　目前合成特定siRNA有两种方法。化学合成法和体外酶学合成法。目前为止较为常用的4种制备siRNA的方法包括：化学合成；体外转录；siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNA; PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达。

体外制备

1．化学合成

　　尽管化学合成是最贵的方法，但却是最方便的。很多公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要缺点是价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列在进行化学合成。

　　最适应于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究。

　　不适用于：筛选siRNA等长时间的研究。主要是价格问题。

体外转录

　　通过体外转录的方法可以合成siRNAs, 这样的成本相对化学合成法而言相对较低，是一种性价比高的筛选siRNA的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快地得到siRNAs。这个方法的不足之处是试验的规模受到限制，虽然一次体外转录能够提供足够做上百次转染的siRNA,但是反应规模和量始终有一定的限制。值得一提的是体外转录得到的siRNA只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。

　　最适用于：筛选siRNAs, 特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。

　　不适用于：试验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。

体内表达

3. siRNA表达载体

　　多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶Ⅲ启动子（pol Ⅲ）中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol Ⅲ 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几天的时间，同时也需要通过测序以保证克隆的序列是正确的。

　　毫无疑问，siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法。带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。

　　最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要较长时间的基因沉默，或者需要用抗生素筛选能表达siRNA的细胞。长期研究。

4．siRNA表达框架

　　siRNA表达框架（siRNA expression cassettes, SECs）是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。该模版包括一个RNA pol Ⅲ 启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol Ⅲ终止位点。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最佳搭配！如果在PCR两端添加梅切位点，那末通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。

　　这个方法的缺点是PCR产物很难转染到细胞中。另外，没有克隆到载体中的PCR片断并不适用于大规模植被。

　　最适用于：筛选PCR序列，在克隆到在提前筛选最佳启动因子