SiRNA对MPTP诱导的PD 小鼠α-synuclein基因表达的抑制及相关蛋白含量的影响

背景与目的

体内异常蛋白的积聚参与了帕金森病的发病过程， 路易氏小体（Lewy body，LB）是α-synuclein由可溶性变为不可溶性异常聚集而成，影响α-synuclei表达和代谢的因素可能与PD的发病有关。目前有研究证明α-synuclein 与帕金森病的病理生理机制有着密切的联系。α-synuclei的聚集能力，特别是在氧化应激状态下，被认为是其病理机制的核心, 总的来说，蛋白质的聚集导致蛋白酶的抑制和细胞死亡。α-synuclei的聚集已经显示出具有特殊的捆绑蛋白从而抑制其功能的作用。相对于野生型的α-synuclein,突变的α-synuclein显示出对氧化应激敏感性增加，同时加速了集聚的活力，这可能由于突变区从α螺旋转换为β褶所导致。突变的α-synuclein 还显示出具有抑制蛋白酶的活动; 同时在有离子参与的情况下，促进 ROS的形成。我们已有的实验也证明，MPTP诱导的PD小鼠模型中，α-synuclein的表达较正常对照组明显增高。

本研究采用RNAi技术对α-synuclein进行研究和干预，探讨SiRNA(small interference RNA ) 对MPTP诱导的PD 小鼠α-synuclein基因表达的抑制作用及相关蛋白含量的影响。

材料与方法

依据Ambion公司提供的设计软件，设计合成以α-synuclein 基因为靶标的三组SiRNA,通过脂质体将合成的SiRNA转入PC12细胞株，以未转染的一组PC12 细胞作对照，经MTT法检测SiRNA对细胞生长的抑制，以RT-PCR和免疫组织化学法检测SiRNA对α-synuclein基因表达的抑制作用， 从三组SiRNA中筛选出抑制作用最为明显的一组SiRNA，

采用立体定向微量注射的方法，对MPTP诱导的PD小鼠进行治疗，同时设立假手术对照组，而后采用免疫组织化学及蛋白印迹分析（western blot）的方法对α-synuclein的表达和 PD相关标志物酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运体2(VMAT2)的可能改变进行检测，并采用高效液相色谱-电化学检测仪(HPLC-ECD)检测纹状体单胺类递质的可能变化。

结果

 ⑴黑质免疫组化染色显示：SiRNA治疗组较假手术对照组TH 阳性细胞数明显增多；⑵纹状体Western blot结果显示：SiRNA治疗组较假手术对照组α-synuclein的表达明显减少；SiRNA治疗组较假手术对照组组TH表达明显增多；DAT在SiRNA治疗组中，与假手术对照组比较明显升高；VMAT2在治疗组中较假手术对照组明显升高；⑶HPLC-ECD显示DA及其代谢产物DOPAC在假手术对照组明显下降，而其他单胺类递质则无明显改变；治疗组DOPAC含量较假手术对照组明显升高（P<0.05）。

结论

立体定向微量注射SiRNA可以对MPTP诱导的小鼠PD产生明显的治疗作用；不但可以减少体内异常集聚α-synuclein的含量，还能够减少DA能神经元死亡，从而增加了DOPAC的含量。

[关键词]  SiRNA；MPTP；帕金森病；RNA干扰