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分光光度计的相关知识-质粒DNA测量(整理)

(2013-07-07 21:48:28)
OD260/280 比值过高?
看你最后一步用什么溶解的,如果是kit中的elution,比值会偏高一点,如果用蒸馏水溶解可能会好一点,但是看你的比值,对你后面的实验应该影响不大。
OD260/230出现负数,你看下是哪个值是负数。如果是260值是负数,那可能是你的DNA量很少,在基线附近,这时候测量往往是不准确的,基线本身就不是一条很平的直线,你的260值就可能出现负值。不是代表没有DNA,只是量少

纯DNA:OD260/OD280≈1.8(>1.9,表明有RNA污染;<1.6,表明有蛋白质、酚等污染)
通过测试OD260可以大概知道样品中核酸的浓度
吸光度出现负值,可能是空白调零不准确,没有使用基质相同的溶液来调零;如果待测样本中浓度过低,读值容易波动,也可能出现负值;还有就是待测样品中存在干扰物质。
OD是optical density(光密度)的缩写, OD=1og(1/trans),其中trans为检测物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数,影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等 吸光系数与入射光的波长以及被光通过的物质有关。只要光的波长被固定下来,同一种物质,吸光系数就不变。 当一束光通过一个吸光物质(通常为溶液)时,溶质吸收了光能,光的强度减弱。吸光度就是用来衡量光被吸收程度的一个物理量。
吸光度用A表示, A=abc,其中a为吸光系数,单位L/(g•cm),b为液层厚度(通常为比色皿的厚度),单位cm ,c为溶液浓度,单位g/L 影响吸光度的因数是b和c。a是与溶质有关的一个常量,温度通过影响c,而影响A。

一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等)的吸光度。 A260/A280与OD260/OD280的意思是一样的。A代表吸光值,而OD是光密度值,一个意思。
A260/280比值一度成为判断核酸纯度的唯一通用标准,纯的DNA一般在1.8-2.0之间;后来发现在抽提过程中使用的许多试剂影响 A260 和 A280 读数;同时,对同一样品 10 倍数量级稀释后测定吸光值发现,分光光度计的吸光值仅在一定的区域是线性的。结论是:当 A260 读数处在 0.1-0.5 之间,A200 到 A320 之间的数值构成一条光滑的曲线时, 4.设备限制:测定OD260及OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM Tris,pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。
比值低可能有蛋白污染,高了可能有DNA污染,建议你抽提的RNA分三管,两管保存,另一管用来跑胶和测定OD,跑胶是最直观的,1%的胶就可以,抽提后马上跑,一般不会降解很多,所以设备材料不需要去酶处理
不会有影响的。你的od比低可能是溶解时用的水的PH值偏酸。可以试着调到8.0左右再测,这样就会上来了。


BioSpec-nano使用说明

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