蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)污染及其对食品安全的影响

  

                                      周帼萍1,2，袁志明1,*

 

    (1.中国科学院武汉病毒研究所，湖北 武汉 430071；2.武汉工业学院生物与制药工程系，湖北 武汉 430023)

 

    收稿日期：2006-02-28

 

    *通讯作者

 

    作者简介：周帼萍(1971-) ，女，副教授，博士研究生，主要从事食品微生物与发酵工程。

 

    摘 要：蜡状芽孢杆菌是常见的食品污染菌，在工业化社会中正成为日益重要的食物病原菌。它能产生一种呕吐毒素和多种肠毒素，主要引发呕吐和腹泻型食物中毒。与蜡状芽孢杆菌同属的苏云金杆菌也能产生类似的肠毒素，近来发现它可能与食品中毒有关。我国应当加强对蜡状芽孢杆菌的监测和研究。

 

    关键词：蜡状芽孢杆菌；苏云金杆菌；食物安全；食物中毒；毒素

 

    Review on Bacillus cereus Contamination Effects on Food Safety

 

    ZHOU Guo-ping1,2，YUAN Zhi-ming1,*

 

    (1.Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China；

 

    2.Department of Bioengineering and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

 

    Abstracts ：As a ubiquitous soil microorganism, Bacillus cereus has become one of the important food-borne pathogens in the industrial societies. This bacterium can produce one emetic toxin and several enterotoxins to cause two distinct types of foodborne illnesses: emetic syndrome and diarrheal illness. Importantly, an entomopathogenic bacterium B.thuringiensis can also produce some enterotoxins similar to B.cereus. I it was recently found to be probably involved in food poisoning. It is necessary to strengthen the research and supervision of B.cereus. for guaranteeing food safety.

 

    Key words：Bacillus cereus；Bacillus thuringiensis；food safety；food poisoning；toxins

 

    中图分类号：Q939.97 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2007)03-0357-05

 

    蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种在自然界中广泛分布的好气、中温、产芽孢的杆菌，是食品和化妆品中常见的污染菌。它同昆虫病原菌苏云金杆菌( B.thuringiensis) ，人畜病原菌炭疽芽孢杆菌( B.anthracis)、蕈状芽孢杆菌(B.mycoides)、韦氏芽孢杆菌(B. weihenstephanensis)组成芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌组(B.cereus group)，它们的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的D N A 同源性[ 1 ] 。

 

    1 蜡状芽孢杆菌污染及其影响

 

    因为蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以无法避免地会污染到食品中。几乎所有种类的食品都曾被报道与蜡状芽孢杆菌引发的食物中毒有关，主要有：乳品、米、蒸煮的米饭和炒饭、调料、干制品( 面粉、奶粉等) 、豆类和豆芽、肉制品、焙烤食品等。

 

    除了个别案例外，由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒通常症状较温和而且不超过24h，而且各国并未要求报告零星发生的食物中毒，所以相当多的这类食物中毒事件并未经报道，导致其数量被大大低估了。目前只有北欧的少数国家公布了比较令人信服的数据：在挪威蜡状芽孢杆菌引发的食物中毒占食物中毒总数(病毒引起的除外)的33%(1988～1993)，而在冰岛为47%(1985～1992)，在芬兰为22%(1992)，在荷兰是8.5%，在丹麦为5% (1990～1992)，在法国为4%～5%(1998～2000)。其它国家以前曾报道的数量则远远低于此比例，例如英格兰和威尔士(0.7%)，日本(0.8%)，美国(1.3%) 以及加拿大(2.2%)[2-3]。最近在挪威和荷兰，通对蜡状芽孢杆菌进行有效的监控，已认定蜡状芽孢杆菌是食品中最常检出的病源微生物[4]。

 

    蜡状芽孢杆菌是条件致病菌，偶尔能导致人的眼部感染，甚至是心内膜炎、脑膜炎和菌血症等疾病，但最常见的是导致两种不同类型的食物中毒：腹泻型和呕吐型。一般认为肠毒素在胃中会被破坏，所以腹泻型食物中毒是由残留下来的蜡状芽孢杆菌(芽孢或菌体)在小肠中生长、产肠毒素引起的，具体过程尚未完全明了。多数情况下，引起该类食物中毒的食品中蜡状芽孢杆菌的数量在105～108CFU/g，也有在数量较低的情况下(103～104CFU/g)导致食物中毒的。其症状类似于产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)食物中毒：水样腹泻、腹部痉挛和疼痛，呕吐很少见。常因食用肉类、海鲜、乳品和蔬菜等食物引起，潜伏期一般为6～15h，一般持续24h；而致呕吐的毒素是该菌在食物中预先产生的，该毒素非常稳定，进入人体后在胃中与其受体5-HT3 结合，导致呕吐。所以尽管有时食物中检出的蜡状芽孢杆菌数量很低(102CFU/g)，却仍能引发呕吐中毒。呕吐型食物中毒的潜伏期一般为0.5 ～6h，一般限于富含淀粉质的食品，特别是炒饭和米饭。主要症状为恶心、呕吐，有时有腹泻、头晕、发烧和四肢无力等症状，与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)引发的食物中毒相似[3,5]。从目前的报道看，由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒在亚洲以呕吐型比较常见，而在欧洲和北美地区则以腹泻型更常见[ 6 ]。

 

    引起这两种食物中毒的食品通常都是经过热加工处理的，但蜡状芽孢杆菌具有耐热的芽孢，往往能在食品加工如巴氏消毒以及烹饪后，残留下来，热处理诱发芽孢的萌发，在没有其它微生物与之竞争的条件下，大量生长繁殖，产生毒素并引起食品的腐败。近十年来在乳品工业中，发现一些耐低温的蜡状芽孢杆菌和韦氏芽孢杆菌能在冷藏温度下(6℃甚至更低)繁殖并产生肠毒素，导致食物中毒，这点引起了各国政府的关注[6-7]。目前美国、澳大利亚和欧盟几个成员国都在其国内法规和法令中对各类食品中的蜡状芽孢杆菌数量有所限定。

 

    2 蜡状芽孢杆菌产生的毒素及其致病机制

 

    2.1 呕吐型毒素

 

    在蜡状芽孢杆菌产生的毒素中，呕吐毒素较危险，摄入30min 后就可能出现呕吐症状，曾经有一位瑞士17岁男孩因食用含大量呕吐毒素的食物引发急性肝衰和横纹肌溶解而死亡[8]。动物试验也证实它对肝脏有损害[9]。该毒素cereulide，1.2kD，是一种十二肽的热稳定性环状毒素，分子式为 (D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3[10-11]。其结构、性质和毒理与缬氨霉素很相似，是特异性的钾离子载体，能将K+转入线粒体内，破坏线粒体的氧化还原能力。但cereulide 的毒性更强，因为在K+ 的生理浓度下，cereulide 比缬氨霉素对K+ 的亲和力更强[12]。该毒素非常稳定，目前的各种食品加工方法，包括灭菌，均无法使其失活(能耐受126℃ 90min)，而且还耐强酸(pH2.0)、耐蛋白酶水解[13]。

 

    N. Agata等对多种食品中cereulide的产量进行了检测，发现对B.cereus NC7401 来说，在煮熟后的米饭中其产毒量很高，在富含淀粉质的食物中的产毒量也足以引起食物中毒；而在肉类、蛋品和密封的液体食品如牛奶和豆奶中虽可以检测到该毒素，但其含量较低。还发现在与醋、蛋黄酱及酱类一起煮的食物中，该菌株的生长和产毒都受到抑制，推测这可能是醋导致pH 降低的缘故[14]。在12～15℃时该毒素的产量却明显高于30℃时的产量，而且该毒素的产生与芽孢的产生没有相关性[13]。还有报道称该毒素只有在有氧条件下才能产生，所以缺氧条件如：充氮包装和真空包装能有效地防止该毒素的产生和积累[15]。

 

    因为该毒素的分子量很小，无抗原性，这使其检测比较难，到目前为之尚缺乏一种快速可靠的检测方法。最常用是采用HEp-2 细胞进行细胞培养分析[16]。此外，该毒素会导致精子运动能力的下降，可以目测到，也可用电脑辅助的精子动力分析仪(CASA)分析样品对公猪精子的运动能力的抑制，进行定性和半定量检测[17-19]。近年来用分子生物学手段(PCR)检测产毒株的报道也较多[20-21]，如P F Horwood 等人根据NRPS 基因的两个可变区的序列，针对产呕吐毒素的菌株设计了特异性的引物，进行PCR 以检测蜡状芽孢杆菌是否是产毒菌株，取得了良好的效果。该法灵敏度更高，而且检测速度更快。通过该试验也证实了该毒素的确是通过一种有模板指导的，非核糖体机制合成的，即由多酶复合体－非核糖体多肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetases，NRPS)所合成[21]。

 

    在呕吐食物中毒事件分离的蜡状芽孢杆菌均产cereulide 毒素，而且有着共同的独特表型特征，对其基因进行分析发现它们构成了一个高度同源的进化系[3,22]。

 

    2.2 腹泻型毒素(肠毒素)

 

    腹泻可能涉及到多个肠毒素基因的产物，目前至少已经发现了5 种不同的肠毒素，包括2 个三元毒素：溶血素BL(Hbl)；非溶血性的肠毒素Nhe；3 个单一基因的产物：细胞毒素K(cytK)、肠毒素T(bceT)和肠毒素HlyII[23]。

 

    Hbl 具有溶血性、细胞毒性和导致皮肤坏死及血管通透的活力，并会在兔肠段结扎试验中导致出现液体积聚现象，所以有人认为Hbl 是蜡状芽孢杆菌导致腹泻和眼内炎的主要毒力因子。它由结合亚基B(37kD)和两个溶血亚基L1(38.5kD)和 L2(43.5kD)组成。L1有细胞毒性，但3 种组分的共同参与可使肠毒素毒力达到最大。编码该毒素的3 个基因位于染色体上，是共转录的，组成了一个操纵子，有4 个不同的基因：hblC、hblD、hblA和hblB，如图1 所示，其中hblb 的功能未知[2]。有研究显示该基因在蜡状芽孢杆菌菌株中分布广泛而且其基因型和表型间有异质性[24]。

 

     1995 年挪威爆发了一次大规模的食物中毒，其中一株蜡状芽孢杆菌的非溶血性的三元肠毒素(Nhe)的3 个组分被纯化出来。该毒素由45、39 和105kD 的蛋白组成[25]。Nhe 与Vero 细胞相互作用的研究表明105kD 蛋白是复合物的结合部位，而其它两个组分是无法单独结合到细胞上去。该1 0 5 k D 蛋白是一种金属蛋白，具有分解明胶和胶原的活力[26]。与hbl 基因不同，编码该毒素的基因位于质粒上[27]。1999 年Granum 等给出了nhe 操纵子的序列，该操纵子有3 个开放式阅读框与，相应的3 个基因分别是：nheA、nheB 和nheC。前两个基因的产物分别为上述的45kD 和39kD 蛋白，而nheC 的产物尚未纯化出来，其功能未知。有趣的是Nhe 和Hbl 蛋白之间在氨基酸序列上具有很高的相似性。这不仅体现在序列比较上，而且其预期二级结构如跨膜螺旋结构域上也是如此，尤其是NheA 与HblC 、NheB 与HblD 、NheC 与HblA[28]。

 

     具有细胞毒性的CytK 是从导致坏死性肠炎的菌株中分离的。其氨基酸序列显示它属于β- 桶孔形成毒素，能在磷脂双分子层中形成直径至少为7 A °的孔，该孔具有微弱的离子选择性，已证实它对人类肠道Caco-2 上皮细胞具有毒性[29]。

 

    Budarina 等人的实验室分离纯化了一种溶血素II(HlyII)，分析其氨基酸序列发现它也属于β-桶孔形成毒素家族，许多芽孢杆菌群的细菌均含有该毒素，如：苏云金杆菌等。纯化后的HlyII 显示出对多种哺乳动物的红细胞有着不同程度的裂解毒性，据推测该毒素可能无需特殊受体就能与细胞膜结合[30-32]。

 

    1995 年有人克隆了一个2.9kb 的DNA，命名为bceT，其产物为41kD 的毒素T ，并认为其有细胞毒性，属于肠毒素蛋白[33]。但是后来的研究证实了该毒素同Hbl 毒素无同源性，而且认为肠毒素T 不会导致食物中毒[34]。

 

    3 蜡状芽孢杆菌与苏云金杆菌

 

    蜡状芽孢杆菌和苏云金杆菌间的区别仅仅在于后者在芽胞形成时能产生位于芽孢孢外膜外的伴胞晶体，该性状由杀虫质粒编码。该质粒的丢失可使苏云金杆菌转化成蜡状芽孢杆菌，反之亦然[3,35]。基因组同源性分析也表明这两种细菌在DNA 水平上无明显的差别[1]，甚至有学者建议应当将两者并入同一个种[36]。由于苏云金杆菌和蜡状芽孢杆菌间的高度同源性，苏云金杆菌安全性问题越来越受到人们的重视。1995 年就有报道称苏云金杆菌杀虫剂的生产菌株均能产生腹泻型肠毒素[35]。此后的许多研究也证实肠毒素基因在苏云金杆菌中是广泛存在的，而且是有表达活性的[37-38]。2000 年一项研究调查了24 个血清型的74 个苏云金杆菌菌株，包括各种商业化生产菌株，它们全部含nheBC，65 株含hblCD 和63株含有bceT 基因。除一株外，其它菌株的发酵液对Vero细胞表现出的毒力均与引起食物中毒的蜡状芽胞杆菌相当[39]。还有报道称来自食品[40]、并与食物中毒事件有关的部分蜡状芽孢杆菌经过仔细分析发现实际上是苏云金杆菌[41]。2005 年对一些即食食物进行调查发现：用传统方法检测的蜡状芽孢杆菌中有相当数量的(70%)菌株实际上是苏云金杆菌，而且某些菌株的表型及基因型特征与某商业化菌株相同，极可能是来自杀虫剂的污染[42]。这可能成为一个很严重的问题，因为苏云金杆菌生物杀虫剂已经在世界各国得到了非常广泛的应用。然而，常规蜡状芽孢杆菌的鉴定方法是无法区分这两种微生物的，可能有些食物中毒的爆发是由苏云金杆菌引起的，但未被鉴定出来。

 

    4 结束语

 

    我国目前还没有对由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒进行比较系统的调查、分析和统计，但是从我国的饮食结构、食品加工、保藏和运输条件来推测：蜡状芽孢杆菌的污染情况应当是比较严重的。随着乳品工业、快餐食品、婴儿食品、学生配餐和快餐业的迅速发展，蜡状芽孢杆菌尤其是耐低温菌株对这些食品的威胁是很大的，有可能导致大规模的食物中毒事件。特别是乳品行业，由蜡状芽孢杆菌引起的食物中毒极可能被误认为是乳糖不耐受症状而被忽视。因此从食品安全的角度来看，很有必要对我国食品中蜡状芽孢杆菌的检出率、分布情况和毒素基因的分布及毒素产生的情况进行调查，以查明污染源、污染途径，制订相应的检测标准和卫生安全标准，提供消毒和杀菌的指导，并为应对可能出现的突发食物中毒事件提供参考依据。

 

    近年来，蜡状芽孢杆菌也被认为是一种有益的微生物，部分菌株开始用作益生素添加到食品和饲料中，还有作为植物生长促进剂使用的[3]。有必要对这些菌株的安全性进行系统的分析和评价。

 

    随着人们环保意识的增强，生物农药的使用越来越普及，生物农药产业日益壮大。大量的苏云金杆菌的施用可能会导致对人体和食品安全的潜在威胁。尤其是蜡状芽孢杆菌和苏云金杆菌之间产毒质粒能进行水平转移，以及许多苏云金杆菌本身就携带肠毒素基因，要求我们对其安全性进行更深入、细致的评估。