浅谈DNA的拓扑学特性（修正版）

 

生物体内有些DNA是以双链环形DNA形式存在的，如某些病毒DNA、某些噬菌体DNA、许多细菌染色体DNA、细菌质粒DNA、真核细胞中的线粒体DNA和叶绿体DNA等。

 

一.基本拓扑学参数

 

自1966年 J.Vinograd 和 J.H.Lebowitz 将拓扑学引入环形DNA的空间几何学特征以来，对双链环形DNA的拓扑学特征研究有长足的进展。

 

首先以一260 bp双链线形B-DNA为例，此DNA在松弛时，螺旋数为25（260/10.4），首尾连接成环形后，为一松弛环形DNA，并处于最稳定状态。若将此线形DNA先拧松2个连环再连成环形，则可以形成两种环形DNA，一种称为松弛解链环形DNA；另一种环形DNA称为超螺旋DNA，其螺旋周数为25，有2个负超螺旋。这个例子为读者所熟悉（参见沈同《生物化学》第2版 上册 P340 图5-8）。

 

由此引入拓扑学参数：

 

1.连环数（Linking number）：在双螺旋DNA中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以 L 表示（或以α表示），其计数方法为处于松弛环形DNA时的螺旋周数，肯定为整数，右手螺旋为正、左手螺旋为负。

 

2.缠绕数（Twisting number）：即DNA分子中的Watson-Crick螺旋周数，以 T 表示(或以β表示)，其数值可直接在处于最稳定状态下的双链环形（或超螺旋形式）DNA中的实际螺旋周数计数得到，不一定是整数，右手螺旋为正，左手螺旋为负。但必须注意T仅针对于形成双螺旋区域而言，解链部分的bp数就不涉及T的计算。对于一定长度的DNA双链，一旦出现解链T值就减少。如260bp B-DNA双链自然状态下T＝25，解链20％时的T＝20 。

 

3.超螺旋数 或 纽数（Writhing number）：其数值有公式 L=T+W 计算得到，以W表示（或以τ表示），不一定为整数。左手超螺旋为正，右手超螺旋为负（此点解释见后）。

 

4.比连环差：为双链DNA的超螺旋密度。用σ表示，由公式σ = L - T / T得到，或以σ = α - β /β 表示。

 

二.DNA双链的拓扑学特征形成原理

 

当一段线形DNA双链的bp值确定后，将其变为环形，此时 L=T=Lo，W=0，这个Lo即是此线形DNA最稳定状态下的连环数，称为最适连环数（Optimum Linking number），此值由此线形DNA的本身性质（bp数、各链的张力及由此体现出的整体的弹性模量）。各链的张力究其根源是由两主链上的化学键具有部分的刚性特征而表现出的。实际上弹性模量与双链DNA的核苷酸组成直接相关。对于特定的DNA群，其整体弹性模量水平确定，则其Lo由公式计算 Lo = N / K，N为双链DNA的bp总数，K为形成1个完整的最稳定螺旋所需的bp数，对于B-DNA此值为K=10.4，A-DNA的 K=11.0，Z-DNA的 K=12.0，K值表征此特定DNA的整体弹性模量水平，K值越大，各链张力越小；K值越小，各链张力越大。

 

这里应该指出对于松弛环形DNA，由于 L = T，故可以用 N / L 表征整体的弹性模量，严格意义下应该以 N / T 来表征。而对于存在超螺旋时，必须以 Ki = N / T 表征此量。

 

对于已知N值的特定线形DNA的 Lo = N / K（可以整除）；Lo = [N / K] + 1（不能整除）。其中[N / K]表示取整数部分。故对于后一种情况，从线形变为环形后多少都存在一点正超螺旋，σ= 1 - {N / K} / （N / K），其中{N / K}表示取小数部分。但对于N很大的情况下可认为σ趋向于0，故对于本文所讨论的情况下，认为仍然由Lo = N / K 计算，此时的环形DNA最稳定。如果减少连环数值至L，则此松弛环形DNA的 Ki = N / L> K，DNA链过于松弛，使整体弹性模量偏离能量最低状态，由于整体弹性模量刚性特点，仍要使整体回复原来的弹性水平K，，故必须引入负超螺旋以增加 T = L - W，这样使 Ki = N / T 仍回复到接近K（即使T接近Lo）。事实上不可能完全回复，故T 介于L 和Lo之间，更接近于Lo，但N很大时可认为此时T = Lo，处于完全回复状态。W = L - T = L - Lo < 0，为负超螺旋。同理，当L变大时，N / L < K，使DNA双链过于紧缠，故也偏离能量最低状态，引入正超螺旋，使T 介于Lo 和L之间，更接近于Lo，但当N很大时可认为此时T = Lo，处于完全回复状态。W = L - T = L - Lo >0，为正超螺旋。

 

在此有必要对超螺旋的正、负的实际意义作一下解释，对照原文解释：the supercoils introduced by underwinding are called “negitive”, while the supercoils introduced by overwinding are called “positive”.并没有提到超螺旋的手性与正负的关系。根据原文当原始螺旋为右手螺旋时，左手的超螺旋为正，右手的超螺旋为负；当原始螺旋为左手螺旋时，右手的超螺旋为正，左手的超螺旋为负。但前面已定义右手螺旋为正，左手螺旋为负，那么无论原始螺旋手性如何，左手超螺旋为正，右手超螺旋为负。两种说法一致，后者更有利计算的统一。

 

另外对K值作一些补充，在实际的DNA分子中对于K值的轻微变化可以不作出调整，K值可以在一定的范围内波动，超出范围即作出调整，引入超螺旋，一般对于K值变小作出的反应比K值增大来得敏感，因为K值变小时变化单位K值所引起的能量偏离更大。

 

那么为何右手螺旋时，其正超螺旋为左手螺旋？这是由能量最低原理决定的，因为与原螺旋系手性相反的超螺旋才可能有松弛作用，手性相同的超螺旋才可能有紧拧作用，故正超螺旋为左手，负超螺旋为左手。这可由简单的实验模拟即可证明。另外当 L 增大或减小时，T都保持趋近于Lo的状态，当然不可能完全等于Lo，仅当N较大时，认为 T = Lo。

 

以上均是从环形闭合双链DNA出发所作的解释，但以上结论对处于长度极大的DNA链中的一段特定线形双链DNA也适用，因为直线是半径无限大的圆的圆周。这样以上理论也可在真核生物染色体DNA的复制、转录中涉及拓扑学特性的问题中加以应用。另外在实验中常利用DNA分子的超螺旋数目差异通过超速离心或凝胶电泳加以区分，且有较高精度，已到达0.1或更高水平。

 

三.拓扑异构酶特性

 

拓扑异构体为N值、弹性模量水平一定，但 L 值不同的DNA分子群。而催化拓扑异构体之间相互转化的分子是拓扑异构酶（TOP）。此类酶的存在可能性由 J.Cairn 于1963年提出，并在不久之后提纯出多种TOP。

 

原核生物中的TOP分为两类：TOP I是使双链中的一条发生断裂并在发生空间关系变化后再连接，反应无需ATP；TOP II则使双链同时断裂，空间关系变化后再连接，反应需ATP。

 

TOP I首先发现于E.Coli中，原称为ω蛋白或转轴酶（Swivelase），分子量110 Kd，由top基因表达。原核生物的TOP I只消除负超螺旋，每次改变L为 +1；真核生物的TOP I 对正、负超螺旋都有消除作用。

 

TOP II由 Martin Gellert 和 James C.Wang 等于1976年提纯，原称为旋转酶（Gyrase），在ATP 存在时，强烈引入负超螺旋，每次可改变 L为 -2，改变 L 速度可达 -100 / min；在无ATP时可松弛负超螺旋，速度仅为其引入负超螺旋速度的1/10，但不作用于正超螺旋。由A2B2组成，A的分子量为105Kd，B的分子量为95Kd，分别由gyrA和gyrB基因表达。

 

TOP广泛存在于原核生物和真核生物，TOP I主要存在于转录活性区，同转录有关：TOP II分部在染色质骨架蛋白和核基质部，同复制有关。由TOP I和TOP II所形成的平衡状态，复制时产生的大量的正超螺旋，需引入高水平的负超螺旋以消除，故复制时TOP II占优势；而复制结束后要降低负超螺旋水平，以便在活性染色质区进行转录，仅保持低水平的负超螺旋，σ保持在 -0.05 - -0.08之间。

 

一般会认为负超螺旋的引入有利于复制或转录，而正超螺旋具有抑制作用。实际上，过度的超螺旋，无论正负均不利于DNA的活化，这点在此予以指出。

 

四.TOP、解链酶与分子生物学相关过程之间的关系

 

TOP 与解链酶（Helicase，也有译为解螺旋酶，不确切，详细见后）是两个易于混淆的概念。TOP 原称旋转酶（Gyrase）或转轴酶（Swivelase），从命名上就可以看出TOP的作用主要是改变双链DNA的拓扑关系，并不解开为两条单链；而解链酶（HEX）仅仅DNA双链解开成为单链用以提供模板，HEX或其类似酶在DNA或RNA相关的多个重要步骤中均参与反应。

 

1. DNA复制的起始阶段及延伸阶段：

DNA复制起始阶段涉及DNA双链的解开，这一步需要解链酶，原先发现有4种蛋白有此功能，rep蛋白、解链酶II、解链酶III和DnaB，Francois Jacob等于1968年经温度敏感突变体实验证实DnaB是E.Coli中最主要的DNA解链酶，DnaG和SSB有协同作用。此酶需要2个ATP。延伸阶段则推进复制叉前行。E.Coli中DnaA可能也有解链酶功能，其可促进ori C左侧的3个重复的13-mer片段解链，形成Open Complex，并易化DnaB对此片段的结合。而此阶段TOP的作用主要由TOP II完成，消除不断产生的正超螺旋（在沈同第2版中的DNA复制一章中认为rep蛋白作用于前导链，解链酶I、解链酶II、解链酶III作用于随从链，相互协同使DNA双链解链，这种说法值得商榷，在第3版中已按照R.F Weaver的Molecular Biology第1版更改）。原核生物DNA（如E.Coli、S.Typh）复制将结束时，新合成的双链的环形DNA与原环形DNA形成连环，那么就必须要解连环。

 

2. DNA转录为RNA的起始阶段：

在原核生物（如E.Coli）中没有专门的解链酶，此功能由RNA Pol 在σ因子的协助下完成。D.C.Hinkle 和 M.J.Chamberlin于1972年证实在σ因子的存在下，使RNA Pol 所覆盖的DNA双链解链，从Closed Promoter Complex转变为Open Promoter Complex，并增强RNA Pol 与解开的DNA链结合，这也是σ因子识别特异性Promoter功能的部分体现。

 

在真核生物（如酵母）中由TFIIH的5个亚单位组成一具有DNA解链酶和ATP酶功能的复合体，需ATP。由TFIIH和TFIIE结合于启动子下游 +3 - +25区，并使该区解链，而启动子区有RNA Pol 固定，此解链效应会向上游传递，使两者之间区域解链，从而促使RNA Pol跳过此区进行转录，此过程称为Promoter Clerance。此观点由Tae-Kyung Kim等于2000年提出。此阶段过后2个因子脱落。

 

而TOP的作用主要由TOP I（原核生物中还应有TOP II参与）完成，消除不断产生的正超螺旋，但此时正超螺旋的生成速度远慢于复制过程，TOP I独立足够完成此功能。另外TOP I可能对σ因子有协同作用，但不是主要的。

 

3. 转录过程中的模板链的局部解链及转录终止时的TOP酶作用：

关于转录时模板链局部解链：Tao-Shih Hsieh 和 James C.Wang等于1978年以T7噬菌体DNA直接以“DNA增色效应”计算出局部解链为 10 bp；Ulrich Siebenlist等于1979年在T7噬菌体DNA中用“腺苷酸甲基化后单链DNA S1核酸酶切割法”证实解链范围为 -9 — +3，为12 bp；前两个实验均无RNA产物存在。Howard Gqmper 和 John Hearst 等于1982年用SV40 DNA以“超螺旋引入法”测定出存在RNA产物时，37 C 时每个RNA Pol引入1.6个超螺旋（由电泳定量测定），即相当于17 bp，而在 5 C 时为18 bp，总结为 17±1。根据实验可以确定在真实的转录状态下，局部解链在12—18 bp范围内，具体如何与实验条件、物种有关。

 

转录终止时，有部分终止依赖 rho 因子。rho 因子以六聚体形式结合于终止子附近的发卡结构之后的RNA链上。Terry Platt于1987年证实 rho 因子有RNA-DNA 解链酶功能。

 

4. RNA翻译的起始阶段：

真核生物的翻译起始阶段中，起始密码子及其邻近核苷酸常形成发卡结构，原核生物的起始密码子也形成二级结构，核糖体在多种因子的协助下根据二级结构的不同情况决定起始翻译或停止。其中也应存在解链酶样作用，因为这种二级结构通常有15个bp以上，与复制、转录时的Open Complex长度相似。而这种二级结构一般较少形成双螺旋形式，而是发卡形式，故译为“解螺旋酶”不甚确切，统一译为“解链酶”。而TOP不参与RNA翻译过程。

 

5. 真核生物的TOP酶：

E.Coli、S.Typh均有4种TOP，为 topo I - IV，（TOP 为种类总称，topo为具体的酶），其中topo I、III 属于 TOP I，topo II、IV 属于 TOP II。如果先解连环然后修复，则 TOP I 即可，但实际上为修复完成后再解连环，故必须有 TOP II 的参与。Nicholas Cozzarelli 等于1992年发现 topo IV 真正发挥解连环功能。同样在细菌染色体的解连环也由topo IV 完成。

 

真核生物染色体中有复制叉存在，两个复制叉之间的关系与两个细菌染色体复制叉相似，需要解连环，在真核生物中 topo II 与细菌的 topo IV 相似，而不仅仅是DNA旋转酶的作用。由于topo II 属于TOP II， 因此在真核生物中也存在 TOP II。

 

这也回答了：jajiz_dna“一个拓扑酶与基因活性的问题” 帖子中 biomahui存在的疑问http://bbs.okhere.net/dispbbs.asp?boardID=18485&ID=249865

 

五.关于三个例题的一些探讨：

 

1. monking网友的问题：一个拓扑酶与基因活性的问题

张玉静的分子生物学上好像说一般情况(也有例外),负超螺旋(自由能最少)利于RNA Pol起始.因为TOP Ⅱ是减少L,也就是增加负超螺旋数,所以应该利于转录的起始.

可是翟中和的细胞生物学(p 292)却说:"实验发现拓扑异构酶Ⅱ抑制果蝇hsp基因的转录;拓扑异构酶I分布于果蝇多线染色体中具转录活性的基因座".

为什么两者的结论恰恰相反,是真核与原核的差别吗?按常理的结论应该是什么?哪个错了?

 

答：沈同的二版中在DNA的复制一章中对拓扑异构酶有详细描述，对以上问题中所提到的两种观点均有阐述，在同一章节中出现的观点并不存在明显的矛盾。原核的TOP I 减少（取消）负超螺旋，真核的TOP I 对正、负超螺旋均有减少作用。TOP II 在真核、原核中却都为增加（引入）负超螺旋，而普遍认为负超螺旋有利于转录，正超螺旋抑制转录。问题的关键就在这里，首先翟中和认为“拓扑异构酶I分布于果蝇多线染色体中具转录活性的基因座”，这完全正确，我查阅多种版本教材均如此描述，此处TOP I 的作用是取消果蝇（真核）基因转录时不断产生的正超螺旋，同时由于复制完成时DNA已处于过度的负超螺旋状态，只有TOP I 可以取消过度的负超螺旋，并仅维持低水平的负超螺旋密度。而双链的解开由转录起始复合体完成在σ因子存在下完成，而非由TOP I 完成，TOP I即使参与也不是主要作用。转录时产生的正超螺旋速度远低于复制，故TOP I足够。找一本转录部分有详细介绍的国外教材即可明了，沈同的对于转录讲得过于简明。我推荐的是中科院研究生教材 Robert Weaver主编的《Molecular Biology》。

 

对于“拓扑异构酶Ⅱ抑制果蝇hsp基因的转录”，其抑制hsp转录活性正是由TOP II 过度引入负超螺旋引起的，沈同二版在复制一章中曾提到，TOP I 与TOP II 维持一种平衡，在复制中TOP II 占优势，而在复制完成后，为进行转录，TOP I 活性加强，减少负超螺旋，仅使负超螺旋维持在低水平上。可以想象过度的超螺旋（不论正负）多会使DNA难以打开，自然造成转录的困难。转录毕竟不是复制，其造成正超螺旋的速度远低于复制。

 

自此作一下总结，张玉静、沈同、翟中和的教材中关于此问题的说法完全一致，只不过未能详细解释。

 

2.mufasha网友的问题：分子的问题

我现在有一个问题，正常DNA的超螺旋密度为-0.05，在无拓扑酶时复制进行到密度0.07时由于阻力而终止，求此时复制百分数？

不太懂，我找不到复制百分数与超螺旋密度值之间的公式？

生化书上没有，

 

附：mufasha的解法

超螺旋密度=alpha-beta/beta

假设唯一有确定构型的链，因为没有拓扑酶所以alpha不变

-0.05beta1=alpha-beta1

0.07beta2=alpha-beta2

beta2/beta1=0.95/1.07=0.88

所以我认为没复制时beta比复制开始后，剩下没复制的部分beta大。因此通过比来确定100%- 88%=12%

注：alpha 即本文的 L，beta即本文的 T。

此解法正确。一般地，x=1-（1+σ1/1+σ2），Ti=L/1+σi。另外可见陈硕贞（在explorer论坛中）的解法。实际应该为11.22％。

 

但关于mufasha网友的“分子的问题”的解法尚有值得商榷之处。这种解法实际上承认引入超螺旋的敏感度不随解链的比值增加而变化。在本文中提到K值的回复问题时，强调K值不可完全复原，在本题中由于没有TOP的参与，故在解链过程中 L 始终不变，但涉及螺旋的区域比值不断下降。当σ=0时，T=L，L-To / To = -0.05，To =L/0.95，并假设从-0.05至0范围内完全恢复，因为此时解链可在较低能量消耗下完成。故x= 1-（L*Ko / Ko*To） =0.05。按照此种算法，在解开x时，其Ki=（L/0.95）*K*（1-x）/Ti=（L/0.95）*K*（0.95/1+σi）/ （L/1+σi）=K 。可见此算法认为在解链过程中Ki不变。但实际过程中Ki会偏离K并逐渐减小。

 

当σ>0时，如果设解链比值为 x，则螺旋区比值为（1 - x），如果认为不引入超螺旋，则Ki=（1-x）To*K / L=（1-x）K/0.95，当x>0.05后，Ki < K，尽管有正超螺旋的补偿以缓解，但无法回到 K水平，而且随着 x的增大越来越远离 K。对于本题有x=1-0.95/1+σ，dx= 0.95/（1+ σ）^2 * dσ，故当σ=0时有，dx =0.95 dσ，即在本题的松弛环形时每引入1％ 的正超螺旋，解开0.95％N，由于负超螺旋状态性质与正超螺旋状态不同，此式在x>0.05时应用。故设 x＝f（Ki）*[0.95/（1+ σ）^2]*dσ，x =0.05 +[ f（Ki）*0.95/（1+ σ）^2在0至+0.07间积分]。根据 Ki=（1-x）K/0.95=1/1+σ，在本题中可设f（Ki）=1/1+σ（x>0.05）。故x =0.05 +[ 0.95/（1+ σ）^3]在0至+0.07间积分]。当然这样有点过于夸大，由于正超螺旋的引入的缓解作用，实际的1/1+σ< f（Ki）<1。而mufasha的解法认为f（Ki）≡1。

 

另外本题中 dσ= 0.95/（1-x）^2 * dx，而在本题实际过程中dσ= （0.95/（1-x）^2）/ f（Ki） * dx，f（Ki）=（1-x）/0.95，故有dσ=0.95^2/（1-x）^3*dx，显性后再解出 x 值。

 

则在考虑 f（Ki）<1后， （1）mufasha的解法：x = 0.12 / 1.07 = 0.1122  （2）应用x=0.05 +[0.95/（1+ σ）^3在0至+0.07间积分] =0.1101 （3）应用dσ=0.95^2/（1-x）^3*dx，其中x >= 0.05，x=0.05时，σ= 0。显性后为σ= 1/2[0.95^2/（1-x）^2]-1/2，σ= 0.07时x = 0.1102。真实的 x 介于 0.1102 和 0.1122 之间，且比较接近 0.1122。本题的答案应该非常接近0.1122，但应该达不到。

 

对于一段长度固定的DNA链，其在一定状态下存在一最适螺旋值，即每一螺旋包含的碱基对数有一定值，如直链为10.4个碱基对一螺旋，3.4nm，而对于环状DNA可能稍小一点（非常接近）。如果达不到此最佳值，若小于10.4bp，就以负超螺旋形式使其达到或接近，若大于10.4bp，则产生正超螺旋以缓解。假设DNA分子为右手螺旋，则左手超螺旋为正，右手超螺旋为负。产生超螺旋的根本动力来自于DNA分子在偏离最佳值状态下，产生较大张力，且方向为回复最佳状态。现实状态下，DNA分子解旋同时，不断产生正超螺旋，但在拓扑异构酶的作用下消除新产生的正超螺旋，σ值仍保持在轻微的负值水平。各类基础生化及分子生物学教材对此问题的解释过于含糊，似乎不愿意多费口舌。其实这个问题对于理解DNA的复制动态过程较为重要，拓扑学在生物学中的应用现已成为一门边缘学科，交叉学科！

 

3.木子石网友的问题：复旦03试题

蛋白质a-螺旋是右手螺旋,为什么aa-超二级结构是左手螺旋？

 

斑竹的回答：作者说的是Coil de coil a-Helices,因为其也是由L-氨基酸构成,所以形成左手超螺旋时,两条相邻的a-螺旋(右手螺旋)的疏水侧链可紧密接触,使缠绕的a-螺旋的构象能量特别低。

 

对于本题倒没有太多可解释的，一般的解释在本文中有叙述，虽然是针对DNA双链，但基本原理也适用于蛋白质a-螺旋，只是想通过例子使读者认识到右手螺旋形成超螺旋时，确实左手超螺旋为正。但要对此问题更深层次的回答恐怕暂时难以给出，如要定量的说明此问题非要给出精确的实验数据。