山东医药2009年49卷12期，1-3.

专家述评：利用基因表达谱预测肝癌术后复发：机遇与挑战

陈红松，谢兴旺

（北京大学人民医院,北京大学肝病研究所，北京 100044）

［关键词］基因表达谱；肝肿瘤；术后复发

［中图分类号］R735.7［文献标识码］A［文章编号］1002266X(2009)12000103

[作者简介］ 陈红松，男，医学博士、研究员。主要从事肝病免疫学研究。国家“八五”至“十一五”期间，承担了“973”、“863”等20余项国家级和省部级科研项目。国内外专业杂志上已发表论文90余篇。1997年获卫生部科技进步一等奖，2007年获得教育部自然科学奖一等奖1项，中华医学科技奖二等奖1项。2005年获得肝癌疫苗专利1项，2006年获得了SFDA的Ⅰ期临床试验批文1项（治疗用生物制品Ⅰ类）。现为国家自然基金、“863”、“973”审评专家库成员，上海市科学技术专家库成员，北京免疫学会理事，北京大学人民医院医学伦理委员会副主任委员、《Journal of Viral Hepatitis》、《Human Immunology》、《Medical Science Monitor》及《Journal of Biochemistry and Molecular Biology》审稿专家。

术后复发是延长肝癌患者术后生存时间最大的障碍，肝癌根治切除术后3 a和5 a的复发率分别高达50%和70%。因此，预防和治疗肝癌术后复发是改善肝癌患者预后的重中之重。目前，虽然行之有效的预防肝癌复发的措施尚未出现，但许多研究已经提示无选择地使用术后化疗等预防措施，可能反而会使部分患者的生存时间缩短。这些现状加剧了对肝癌术后复发预后指标、临床分期体系或者预测模型的需求，以指导患者的术后治疗。

1利用基因表达谱预测肝癌术后复发：机遇

基因芯片技术的出现，为在全基因组范围内研究与肿瘤发生、发展相关的基因变化提供了一个强有力的手段，其一次实验、一次杂交反应就能在全基因组范围内同时分析待测样本中成千上万个基因的表达情况，以及它们之间相互作用的关系，具有快速、平行、高效、高通量地分析生物信息的特点，彻底改变了传统的单基因研究模式。根据个体的肿瘤组织中的基因表达调节情况，可以进行肿瘤的早期诊断、肿瘤相关的分子标志物和潜在药物靶点的识别，更加具有临床意义的是可以根据基因表达模式的不同预测肿瘤的复发转移、预后及治疗的疗效，对临床个性化有效治疗具有较高的指导价值。2007年2月，美国食品药物管理局（FDA）批准了荷兰Agendia公司的MammaPrint基因表达谱芯片。这是世界上首个被FDA批准上市的用于预测疾病预后的芯片产品。该芯片包含70个与乳腺癌预后相关的基因，基于乳腺癌手术切除组织中这70个基因的表达模式，可以预测乳腺癌患者在乳腺癌根治术后的5～10 a内乳腺癌复发的可能性，准确率达到85%。明显优于基于临床指标或者单个分子的预后效果。

在肝癌中，用基因表达谱预测术后肝内转移复发、多中心复发的多个研究结果均显示，基于原发肿瘤或者瘤旁组织基因表达谱的预测模型对于患者术后复发和预后的预测明显优于临床分期体系或者单个临床/分子指标，这些预测模型对于肝癌患者术后不同阶段复发风险预测的准确度可以达到73%～93%。虽然，这些预测模型目前还很难具有临床应用的价值，但是相对于临床预测模型、分期系统和单个预测指标而言，基因表达谱对肝癌术后复发或者预后的预测能力值得我们期待。

2利用基因表达谱预测肝癌术后复发：挑战

现有利用基因表达谱来预测肿瘤预后的研究，证实了肿瘤或者瘤旁组织的基因表达模式的确与患者的术后复发风险和预后相关，展示了继续深入研究该领域的价值。但是，我们必须清醒的认识到这些研究结果大部分还只是非常初步的探索，研究得出的复发相关基因之间很少有重叠，复发预测模型很难在独立的实验或者样本中得到重复。要开发出临床可行的预测模型，还有许多的问题和挑战有待解决。

2.1样本量统计学评估提示，使用基因表达谱分析来预测肿瘤的复发、转移和预后，至少需要千例以上的临床病例才能够构建出可信的、临床可行的预测模型。而且，肝癌由于慢性肝病、肝硬化等背景，无论疾病的发生、发展，还是复发转移的分子机制都较乳腺癌等肿瘤复杂，构建预测肝癌复发预后的模型也许需要更大的样本量。而现有的文献报道中，Hoshida等的研究使用的样本量最大，模型训练组和检测组总共307例患者，另外一些研究甚至只使用几十例样本。基于小的样本量进行的研究可能会有一些有意义的发现，但是对于构建临床广泛适用的预测模型还远远不够。所以，需要大规模的多中心合作，规范的患者随访和严密的实验设计来完成预测模型的构建，这是一项耗时耗资的巨大工程。Hoshida等的研究中成功的使用了保存多年的石蜡标本作为表达谱分析研究材料，并且证明使用石蜡标本同样可以获取高质量的表达谱数据。这一技术拓宽了研究标本的来源，降低了大量样本获取的难度。因为，相对液氮冻存标本来说，石蜡标本是几乎所有手术患者常规留存的标本之一，在几乎所有规模的医院都可以获取。

2.2肝癌复发来源的影响肝癌的术后复发包括两种来源，其一是根治术后原发瘤残留在肝内的微小转移灶逐渐增长为复发的肿瘤，此类型的复发实际上是一种肝内转移又被称作“单中心复发”（多发生于术后2 a之内）；另外一种复发则是因为手术后残留肝组织中致癌的因素持续存在，完全新发的肿瘤，再发的肿瘤与原发瘤来源于不同的细胞克隆，此种类型的复发又被称作“多中心复发”（多发生于术后2 a之后）。现有的一些研究趋向于用一个单一的复发预测模型来预测肝癌的术后复发；但实际上，用单一的预测模型来预测肝癌术后所有可能的复发风险并不科学。如果不对肝癌术后复发类型进行区分，用于建立预测模型的训练样本可能会有明显的选择偏倚，从而导致样本量的代表性减小，这样构建出的预测模型很难在大样本的验证中得出好的结论。例如，一些研究者习惯将肝癌的早期复发定义为术后1 a内复发（高复发风险组），而将晚期复发定义为术后1 a之后复发（低复发风险组）。这样的样本分组方式忽略了术后多中心复发的情况，由于多中心复发是完全新发的肿瘤，常出现在手术切除2 a之后，如果建立模型时，简单的将术后1 a内不复发的患者归为低复发风险组，则所建立的模型很难正确的判断患者出现术后多中心复发的风险，这样的模型在大样本预测中的表现和临床应用推广价值很不乐观。在笔者课题组的一项研究中，就放弃了直接根据习惯将患者分组的方式进行研究，而是利用跟术后无瘤生存时间相关的基因来聚类参与分析的临床样本，结果发现这一群基因将3 a内复发的患者分为预后不良组，而将3 a内不复发的分为预后良好组。如果直接将术后1 a内复发与不复发的患者进行比较，很难真正地找到复发相关的基因，也难以构建出有效的预测模型。

更为合理的复发预测模型构建方法或许应该将单中心复发和多中心复发的风险分别进行评估。区分研究样本的术后复发类型，然后在术后肝内转移导致复发和新发肿瘤导致复发两类样本中独立地进行预测模型构建和评估，结果可以得到肝癌患者术后出现单中心复发和多中心复发风险的两个预测模型。用这两个模型对肝癌患者进行评估，既可以得到该患者出现单中心复发的风险，又可以预测该患者出现多中心复发的风险。一些研究已经部分体现了这样的构思，例如，Ye等专门构建了预测术后肝内转移风险的预测模型，Okamoto等则构建了预测术后多中心复发风险的模型。不过，迄今为止还没有任何研究基于一个样本群同时构建两类复发预测模型，并同时评价一个患者单中心和多中心复发的风险。另外，进行术后复发类型的判断时，必须要采用HBV整合型分析和比较基因组杂交(CGH)分析等更为可靠的手段进行，因为出现时间较早的复发中也有新发肿瘤的情况，而肝内转移导致的复发同样可能在2 a后或者更晚才出现临床可诊断的转移灶，而现有研究多只根据出现复发的时间来进行判断。

2.3用于预测的标本：癌还是癌旁在既往的研究中，既有使用肝癌组织的基因表达谱预测术后复发的研究和报道，也有使用癌旁组织的基因表达谱预测术后复发的研究和报道。Hoshida等的最新研究甚至发现癌组织的表达谱并不能够预测术后复发，而癌旁组织的表达谱才能够预测复发。不过，在Hoshida等的研究中，基于癌旁组织的基因表达模式虽然与患者手术2 a之后的复发显著相关（P=0.003），但是与患者手术后2 a内的复发却没有明显的相关性。综合看来，可能肝癌组织本身的表达谱对于术后的单中心复发具有较好地预测作用（主要在术后2 a内发生）；而癌旁组织的基因表达谱对于肝癌患者术后多中心复发具有较好地预测作用（主要在术后2 a之后发生）。从机制上分析，肝癌肝内转移与肝癌本身的侵袭性、抗凋亡能力、免疫逃逸能力和诱导免疫耐受的能力相关，这些因素应该能够被肿瘤组织的表达谱特征反映。而肝癌根治术后多中心复发则是由于术后残留肝组织的致癌因素或者癌前病变持续存在，经过一段时间后新生一个独立的肿瘤，所以癌旁组织的基因表达谱特征更能够反映患者在手术后多中心复发的可能性。这只是一个初步的设想，需要更多深入严谨的实验来证实。如果此设想成立，随之而来的问题是：多中心复发时术后残留肝组织中的癌前病变可能并不均一，还没有证据支持术后癌周组织的特性能够反映残留肝脏组织的普遍情况。采用肝癌手术后多个肝脏部位的穿刺标本来比较癌周肝组织的表达谱特征是否在残留肝脏组织中普遍存在，有助于阐明这一问题。或许不同病因导致的肝癌中，情形会完全不同。阐明这一问题的另一重要意义在于，如果肝癌术后癌旁肝组织的基因表达谱能够预测新发肿瘤的风险，那么在HBV携带者等肝癌发病高风险人群中，是否能够基于局部肝穿刺标本的表达谱特征来预测肝癌发生的风险？这些都是十分有前景的研究领域。

2.4芯片还是Real time PCR全基因组或者高通量表达谱芯片具有许多无法比拟的优势，但是其设备昂贵复杂，耗时长，而且还有假阳性率高等诸多问题，使其临床推广的范围和价值受到限制。可能的两种转化方法是利用低通量的定制芯片和Real time PCR试剂盒来检测预测模型中所含基因的表达水平。从目前的报道看来，两种转化方式都有可取之处。如果预测模型基于的基因数量较多，则低通量的定制芯片可能是上佳选择，典型的代表仍然是MammaPrint。该芯片包含70个乳腺癌预后基因和相关制控基因的检测探针，每张芯片可以同时检测8例样本。在多中心的研究中，MammaPrint显示了极高的临床应用价值。但是，如果预测模型中的基因数量比较少（几个到十数个），也可以用包含这些基因的荧光定量PCR试剂盒进行检测。Budhu等将全基因组芯片筛选出的预后相关基因使用Real time PCR在更大的独立样本中验证了其预测效果，结果显示基于定量PCR的预测模型也具有很强的应用价值。但是，目前还没有定制低通量芯片和Real time PCR两种方法在肿瘤预测预后中应用效果的对照临床研究。孰优孰劣，还需要更多的探索和实践来检验。

3展望

目前基于基因表达谱的肝癌复发预测模型还处于研究的初始阶段，距离其临床应用还有距离。随着高通量测序技术、表观遗传学、生物信息学和系统生物学的发展，突变位点、甲基化位点等信息也可能通过系统生物学的策略被采纳到预测复发和转移的模型中来；预测准确度更高、更易于临床推广的预测模型、芯片或者定量试剂盒将是未来的研究重点，并终有一天会走进肿瘤预防和治疗等临床工作中。