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1、产品概述：本试剂盒采用聚合酶链式反应（PCR）技术检测，可用于检测各种待检标本(如血液、粪便、食物、生物材料等)中所感染的特定细菌或病毒的某一特定基因，进而确定该细菌或病毒的感染/污染状态。试剂盒中所含引物能特异性扩增该细菌或者病毒的保守区域，不会交叉扩增细胞基因组。与传统的选择性培养基培养检测方法和免疫血清学检测方法相比较，本方法更为快速，特异性更高。

2、试剂盒结构组成：

①    10mM dNTP；

②    5×Taq 聚合酶buffer(包含引物F和R)；

③    Taq 聚合酶；

④    阳性对照DNA；

⑤    阴性对照DNA；

⑥    加样缓冲液；

⑦    灭菌超纯水。

⑧    常规PCR检测试剂盒说明书。

3、基本原理：

通过大量对比某一种细菌或病毒的基因，得到该细菌或病毒共同保守序列，根据该序列设计特异性引物，通过PCR扩增，即可获得相应大小的片段，以此来检测该细菌或者病毒的感染/污染状态。

原理示意如下图一：

PCR检测试剂盒中含有聚合酶链式反应所需要各种试剂组分，如：引物、dNTPs、缓冲液、Taq酶等，PCR反应液混合液中加入检测样品，即可进行PCR扩增反应。PCR扩增产物经琼脂糖电泳染色判断，阳性样本将在相应大小的片段处出现特异性条带。

4、预期用途：

     本品为常规PCR检测试剂盒，供体外检测使用。通过检测可以确认各种待检标本(如血液、粪便、食物、生物材料等) 否感染或污染特定细菌或者病毒。

5、操作步骤

（1）标本的收集和预处理：加100-1000μl样本（血液或食物提取物等）于1.5ml EP管中，台式高速离心机最高速离心5分钟，弃上清，沉淀用残液混匀作为检测摸板。DNA样本的进一步纯化，采用等量酚-氯仿抽提，商业DNA纯化柱纯化(详细步骤按Qiagen说明书进行)

①：加100-200μl样本于1.5ml EP管中加等量的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提，漩涡振荡，台式离心机离心最高速5分钟。

②：上清100-200μl转移至新EP管中，加等量氯仿，振荡，离心。

③：上清加4倍的Qiagen结合缓冲液移至纯化柱，洗涤缓冲液洗柱两次，加50μl dH2O洗脱收集纯化的样本。

如为RNA样本，需纯化后，进一步逆转录为cDNA，再进行检测。

（2）PCR反应：

dH2O                                         37.5μl

5×Taq聚合酶buffer (包含引物)                  10μl

Taq聚合酶                                    0.5μl

10mM dNTP                                    1μl

样本摸板或对照DNA                             1μl

Up  to  50μl

进行如下热循环：  

预变性                94℃ for 5min

变性                94℃ for 30sec

  退火                54℃ for 30sec      25–30cycles

  延伸                72℃ for 30-40sec

延伸                72℃ for 5min

                      Cool down to 4℃

6、结果分析：

PCR产物凝胶电泳，PCR反应管单向传递至另设一间专门独立的电泳实验室，根据片段大小经1.0-2.0%琼脂糖凝胶电泳分析，电泳缓冲液中加入适量亲合素标记的琼脂糖凝胶颗粒，在紫外下观察结果，若出现与阳性对照相同的条带即为该细菌和病毒阳性，而阴性对照没有特异性扩增条带。

7、注意事项：

① 开始检测前请仔细阅读该产品简介全文。

②操作时应尽量避免说话，以免引起样品污染，而造成假阳性。

③ 整个检测过程中，反应体系的配制、样本处理及加样、PCR扩增应分区域进行，以避免交叉污染。

④ 尽量使用一次性材料，包括过滤芯吸头，EP试管，橡胶手套等。

⑤ 实验时，试剂盒组成中的试剂除酶外使用前应置4℃提前融化（混匀时禁止激烈振荡），酶始终置于-20℃保存。

⑥ 检测反应管中加入所有的试剂后，应尽快上PCR仪进行扩增，以免扩增冷启动及形成过多的二聚体。

⑦保存:－20 ℃, 保质期一年。