刘涛题记：我不能说是PCR引物设计的专家，但读研究生及工作期间一直从事生物行业，对PCR引物设计略知一二，看到网络中众多关于引物设计策略的文章大多是抄袭而来，有误人子弟之嫌，特就引物设计心得体会罗列如下，以期旁征博引，如有不妥请指出！

    PCR引物设计的目的是选择一段特异序列，以便有效地扩增特异的DNA序列。
引物设计原则：
1、引物长度一般在18-30碱基之间：太短会引起非特异性片段产生，太长可以增加特异性，但会增加成本，且易形成二级结构。

2、G+C含量在40-60%之间，GC含量高或低都不利于PCR反应。
3、产物不能形成二级结构：避免出现二级结构的有效方法是，选择GC含量在50%左右，缺少一种碱基的引物。
4、碱基最好随机分布:(1)避免出现4个或更多的核苷酸重复，如（...GCATA...GCATA...）(2)避免出现4个或更多的核苷酸形成自身互补，如（...GCATA...TATGC...）(3)避免出

现4个或更多的核苷酸单一重复序列，如（...AAAAAA...）
5、GC夹：在引物3’端含有一个G或C,可以提高扩增效果。
6、非目标同源性：把选定引物进行BLAST比较，看有无同源性。---www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
7、密码子简并：如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
8、退火温度：Tm=4（G+C）+2（A+T），估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。。。。。

由于时间限制，PCR引物设计还有很多原则，不能一一列举！