微生物固氮及其发展前景概述

（孙闯 天津农学院职业技术学院 生物工程系 08生物技术班 2009.05.20）

 

摘要 本文简略概述了微生物固氮的原理及其生化机制；固氮微生物的类型；微生物固氮的发展前景等内容。

关键词 生物固氮 固氮微生物 微生物工程 生化 发展前景

 

1. 生物固氮

1.1 生物固氮的概念

生物固氮(biological nitrogen fixation)是指大气中的分子氮通过微生物固氮酶的催化而还原成氨的过程。生物界中只有原核微生物才具有固氮能力。生物固氮反应是一种极其温和的生化反应，它比人类发明的化学固氮有着无比优越性。

1.2 固氮微生物

1.2.1 固氮微生物概念

固氮微生物(nitrogen-fixing organisms, diazotrophs)主要是指具有固氮功能的细菌，还包括有固氮功能的蓝藻和放线菌。

1.2.2 固氮微生物的类型

最早发现的固氮微生物是共生的根瘤菌属(Rhizobium)和自生的固氮菌属(Azotobacter)，他们分别于1886年和1901年由荷兰著名学者、微生物学中Delft学派的奠基人M.Beijerinck所分离。目前知道的固氮微生物都属于原核生物和古生菌类。根据固氮微生物的固氮特点以及与植物的关系，可以将它们分为自生固氮微生物、共生固氮微生物和联合固氮微生物三类。

（1）自生固氮菌在土壤或培养基中生活时，可以自行固定空气中的分子态氮，对植物没有依存关系。常见的自生固氮微生物包括以圆褐固氮菌为代表的好氧性自生固氮菌、以梭菌为代表的厌氧性自生固氮菌，以及以鱼腥藻、念珠藻和颤藻为代表的具有异形胞的固氮蓝藻（异形胞内含有固氮酶，可以进行生物固氮）。

（2）共生固氮微生物只有和植物互利共生时，才能固定空气中的分子态氮。共生固氮微生物可以分为两类：一类是与豆科植物互利共生的根瘤菌，以及与桤木属、杨梅属和沙棘属等非豆科植物共生的弗兰克氏放线菌；另一类是与红萍（又叫做满江红）等水生蕨类植物或罗汉松等裸子植物共生的蓝藻。由蓝藻和某些真菌形成的地衣也属于这一类。

（3）有些固氮微生物如固氮螺菌、雀稗固氮菌等，能够生活在玉米、雀稗、水稻和甘蔗等植物根内的皮层细胞之间。这些固氮微生物和共生的植物之间具有一定的专一性，但是不形成根瘤那样的特殊结构。这些微生物还能够自行固氮，它们的固氮特点介于自生固氮和共生固氮之间，这种固氮形式叫做联合固氮。

 

2. 生物固氮的生化机制

生物固氮是一个具有重大理论意义和实用价值的生发反应过程。

2.1 固氮的生化途径

目前所知道的生物固氮的总反应是：

N₂+8[H]+18~24ATP → 2NH₃+H₂+18~24ADP+18~24Pi

2.1.1 固氮过程

（1）由Fd或Fld向氧化型固二氮酶还原酶的铁原子提供一个电子，使其还原；

（2）还原型的固二氮酶还原酶与ATP-Mg结合，改变了构想；

（3）固二氮酶在“FeMoCo”的Mo位点上与分子氮结合，并与固二氮酶还原酶-Mg-ATP复合物反应，形成一个1:1复合物，即完整的固氮酶；

（4）在固氮酶分子上，有一个电子从固二氮酶还原酶-Mg-ATP复合物转移到固二氮酶的铁原子上，这是固二氮酶还原酶重新转变成氧化态，同时ATP也水解成ADP和Pi；

（5）通过上述过程连续六次的运转，才可使固氮酶释放两分子的NH₃；、

（6）还原一个N₂分子，理论上仅需6个电子，而实际测定却需要8个电子，有两个电子用于产H₂上（有待进一步研究）。

2.1.2 固氮酶的产氢反应

固氮酶除了能催化N₂ → NH₃外，还能催化2H⁺+2e → H₂ 反应的氢化酶活性。当固氮菌在缺N2的情况下，起固氮酶可将H⁺全部还原成H₂释放；在有N₂的环境下，也只是把75%的还原力[H]去还原N₂，而把另外25%的[H]以产H₂的方式浪费掉了。然而在大多数固氮菌中，还存在另外一种经典的氢化酶(hydrogenase)，它能将没固氮酶浪费的分子氢重新激活，以回收一部分还原力的[H]和ATP。

2.2 生物固氮反应的6要素

（1）ATP的供应

由于N ≡ N分子中存在3个共价键，故要把这种极端稳固的分子打开就要花费巨大的能量。固氮过程中把N₂还原成2NH₃时消耗大量的ATP是由呼吸、厌氧呼吸、发酵或光合磷酸化作用提供的。

（2）还原力[H]及其传递体

固氮反应中需要大量的还原力[H]，必须以NAD(P)H+H⁺的形式提供。还原力[H]由低电位势的电子载体铁氧化蛋白(Fd)或者黄素氧化蛋白(Fld)传递至固氮酶上。

（3）固氮酶(nitrogenase)

固氮酶是一种复合蛋白。由固二氮酶和孤儿但还原酶两种相互分离的蛋白构成。固二氮酶是一种含有铁元素和钼元素的蛋白，铁和钼构成一个称为“FeMoCo”的辅因子，它不是还原N₂的活性中心。而固二氮酶还原酶则是一种只含铁的蛋白。某些固氮菌处于不同生长环境的条件下，还可以合成其他不含钼的固氮酶。

（4）还原底物——N₂

（5）镁离子（Mg）

（6）严格的厌氧微环境

 

3. 生物固氮的意义

大气中的氮，必须通过以生物固氮为主的固氮作用，才能被植物吸收利用。动物直接或间接地以植物为食物。动物体内的一部分蛋白质在分解过程中产生的尿素等含氮废物，以及动植物遗体中的含氮物质，被土壤中的微生物分解后形成氨，氨经过土壤中的消化细菌的作用，最终转化成硝酸盐，硝酸盐可以被植物吸收利用。在氧气不足的情况下，土壤中的另一些细菌可以将硝酸盐转化成亚硝酸盐并最终转化成氮气，氮气则返回到大气中。除了生物固氮以外，生产氮素化肥的工厂以及闪电等也可以固氮，但是，同生物固氮相比，它们所固定的氮素数量很少。可见，生物固氮在自然界氮循环中具有十分重要的作用。

 

4. 生物固氮的应用及发展前景

4.1生物固氮在农业生产中的应用

生物固氮在农业生产中具有十分重要的作用。氮素是农作物从土壤中吸收的一种大量元素，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果土壤每年得不到足够的氮素以弥补损失，土壤的含氮量就会下降。土壤可以通过两条途径获得氮素：一条是含氮肥料（包括氮素化肥和各种农家肥料）的施用；另一条是生物固氮。科学家在20世纪80年代推算过，全世界每年施用的氮素化肥中的氮素大约有8*10⁷t，而自然界每年通过生物固氮所提供的氮素，则高达4*10⁸t。

　　对豆科作物进行根瘤菌拌种，是提高豆科作物产量的一项有效措施。播种前，将豆科作物的种子沾上与该种豆科作物相适应的根瘤菌，这显然有利于该种豆科作物结瘤固氮。特别是新开垦的农田和未种植过豆科作物的土壤中，根瘤菌很少，并且常常不能使豆科作物结瘤固氮，更需要进行根瘤菌拌种。对比实验表明，在其他条件相同的情况下，经过根瘤菌拌种的豆科作物，可以增产10%～20%。

用豆科值物做绿肥，例如将田箐、苜蓿或紫云英等的新鲜植物直接耕埋或堆沤后施用到农田中，可以明显增加土壤中氮的含量。科学家统计过，一般地说，1hm²农田使用7500kg绿肥，可以增产粮食750kg。如果用新鲜的豆科植物饲养家畜，再将家畜的粪便还田，则既可以使土壤肥沃，又可以获得更多的粮食和畜产品。

4.2 我国固氮研究历史的突出亮点

我们这门科学是一个交叉学科，包括农学、化学、物理学和生物学，而生物学中又包括遗传学、分子生物学、生物化学、生物物理学等学科。我国最早开始这方面研究的老前辈是卢嘉锡、唐敖庆、蔡启瑞、沈善炯和陈华葵等，他们在国内带起了一支研究固氮的队伍。

　　由于固氮酶催化固氮的活性中心实际上是金属原子簇，上世纪70年代，卢嘉锡等科学前辈用量子化学计算出这个金属原子簇是一个网兜模型，1992年，这个金属原子簇的空间结构被美国加州理工学院解析出来，证实了这种晶体结构与卢先生预测的几乎一模一样。这个成就在国际上是公认的。

4.3 固氮研究的国际背景

研究生物固氮的意义主要有以下两个方面。

（1）能源问题。由于氮肥的制造是一个高耗能的过程，生物固氮研究的重要性一般都是在石油资源有危机的时候凸现出来。如上世纪70年代的石油危机，以及目前海湾地区的不稳定性和石油价格飞涨，都使生物固氮研究得到更加应有的重视。

　　（2）环境压力。化肥施到土地里，只有30%被植物吸收，另外70%进入土壤水体，造成富营养化。有资料显示，我国农业对环境污染的“贡献率”达到20%以上，如滇池污染中，农业面源污染对于总氮、总磷含量的贡献率已分别高达43.3%和37.1%。因为我国是施用氮肥最多的国家之一，化肥作为一种农业生产资料得到国家的控制，相对比较便宜的同时，滥施现象也比较严重。而生物固氮就不会对环境造成破坏。

如果主要农作物能够自主固氮，就可以摆脱对化肥的依赖性，既节省能源，又能对环境友好。这是继工业革命之后，人们期待的一次“绿色革命”。

4.4 生物固氮的研究方向

    随着分子生物学的进展，固氮的遗传工程受到了广泛重视，已成为目前最活跃的研究领域。遗传工程是用人工方法去改变生物体的遗传特性或者按照人们的意愿去创造新物种。对于固氮微生物来说，固氮基因操纵和调节固氮酶的合成，从而使固氮微生物具有固氮作用。如果将固氮基因进行人工转移，就可能获得具有固氮作用的新物种。

有关这方面的研究目前主要在以下几方面进行探索：一是培育新的固氮微生物，以提高固氮效率或赋予非固氮微生物以固氮能力；二是改变结瘤的识别过程或将固氮基因转移到根瘤病杆菌中，以使非豆科植物结瘤固氮，扩大固氮作物的范围；三是应用遗传工程培育不依赖固氮微生物的自主固氮的植物。这些研究如能成功，将对农业生产产生深刻的影响。

 

5. 总结

自然界有两大生命现象，即光合作用和固氮作用。光合作用是将空气中的二氧化碳固定成碳水化合物，而固氮作用是将空气中的氮气固定成氨。人类与许多其它生物一样需要氮素作为合成蛋白质的原料，但不能自我合成有机氮。虽然空气中有78%是氮气，但是绝大多数生物不能直接利用空气中的氮气。在能源紧张和环境污染的双重压力下，传统的固氮方式已经难以适应各种需求，使生物固氮研究得到更加应有的重视。如果主要农作物能够自主固氮，就可以摆脱对化肥的依赖性，既节省能源，又能对环境友好。这是继工业革命之后，人们期待的一次“绿色革命”。

如今，生物固氮已经越来越受到专家、学者和普通百姓的重视，并且已经应用到农业等领域去。接下来，生物固氮的发展方向将会向更深更微的方向发展。将会涉及到农学、化学、物理学和生物学，而生物学中又包括遗传学、分子生物学、生物化学、生物物理学等学科。相信生物固氮将是一个非常有前景的课题。

 

参考文献

[1]周德庆. 微生物学教程. 北京:高等教育出版社,2002.

[2]王忆平. 浅谈生物固氮. 微生物工程. 北京:科学出版社,2004.

[3]蔡启瑞. 微生物与固氮. 微生物工程. 北京:科学出版社,2004.

[4]王忆平. 生物固氮. 微生物与农业. 上海:化工出版社,2003.