实验目的:

1.学习F-2500型荧光分光光度计的使用方法

2.掌握荧光分光光度法定性分析、定量分析的基本方法

基本原理:

任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱,发射波长总是大于激发波长。荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率。荧光发射光谱是当荧光物质在固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线，表示在所发射的荧光中各种波长相对强度。由于各种不同的荧光物质有它们各自特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质。有些发荧光的物质其荧光强度与物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量。

仪器与试剂

1．F-2500型荧光分光光度计

2．1cm石英吸收池2个, 移液管，烧杯，容量瓶(25ml)，吸耳球

维生素B₂标准溶液（10μg/ml）; 维生素B₂样品液化气；醋酸（0.5mol/L）

实验方法

（一）定性分析

1．移取5ml维生素B₂标准溶液于25ml容量瓶中,用0.5mol/LHAc稀释至刻度，摇匀，放入石英吸收池中。在700V电压中，在450nm—600 nm范围内扫描标准溶液的发射光谱，通过谱图的分析，确定其最佳荧光发射峰波长（522nm）。

2．设荧光发射峰为步骤1获得的荧光发射峰波长，在350nm—500 nm范围内扫描标准溶液的激发光谱，确定其最佳荧光激发峰波长（371nm）。

3．以步骤1获得的激发波长为激发波长，扫描名物质的荧光光谱，观察所得到的光谱与步骤1得到光谱的异同。

（二）定量分析

1．标准曲线制作：准确取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml维生素B₂标准溶液于5个25ml容量瓶中,用0.5mol/LHAc稀释至刻度，摇匀，在激发波长371nm,荧光波长522nm处测定荧光强度,以浓度对荧光强度绘制标准曲线。

2．维生素B₂含量测定：取2.0ml维生素B₂待测溶液于25ml容量瓶中,用0.5mol/LHAc稀释至刻度，摇匀；在激发波长371nm,荧光波长522nm处测定荧光强度，根据标准曲线计算维生素B₂含量。

数据及结果分析

1）定性分析实验记录

2）定量分析实验记录

由标准曲线可得维生素B2含量为0.46ug/ml。

讨论

1．实验开始时，应先开光谱仪主机电源，预热五分钟后再开电脑主机，二者顺序不能颠倒，以防光谱仪主机开机后产生的高压损坏电脑主机。

2．样品测量结束时，就先关闭Xe灯，再进行数据处理。为了延长Xe灯的使用寿命，不要在开着Xe灯的状态下处理数据。

3．测量完毕时，关机顺序为：先关电脑主机，然后关光谱仪主机。（务必等到Xe灯冷却后）

4.干扰荧光分光分光度法的因素：

(1)溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大。

(2)温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。

(3)PH：大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受PH的影响很大。

(4)溶液表面活性剂的存在，减少非辐射跃迁的概率，提高了荧光效率。

(5)溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，使激发单重态分子向三重态的体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低。

5． 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？

原因：维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者的荧光比核黄素的荧光强的多。因此，测量时溶液要控制在酸性范围内，且必须在避光条件下进行。

6．应如何确定被测物的激发和发射波长

一般可将仪器的激发波长(Ex)先设定为200nm，然后进行发射波长(Em)模式扫描，(Em)波长范围暂设定为210－800nm，然后记录所有出现的峰值波长；改变激发波长(Ex)后再扫描，如第二次发射图谱中的某个（或某些）峰的位置没有位移（或位移很少），一般来说这个（或这些）峰就是荧光峰；因为荧光峰的位置是不随激发波长的改变而改变的，仅是峰高（或峰面积）发生改变。

将确定的荧光峰的波长作为发射波长(Em)固定下来，再做激发波长(Ex)的扫描，激发波长的范围要小于发射波长（根据斯拖克斯定律）；如果仅出一个峰则很简单确立下来，再将这个波长固定下来重新做真正的发射波长(Em)扫描，可以得到良好的信噪比的结果值；如果做激发波长(EX)扫描后出现几个峰，则需要作出选择，一般选择峰形高度适合并又有一定带宽的峰为激发波长。