1.
收集5-10毫升EDTA抗凝血,3000rpm离心10分钟,用一次性塑料吸管吸出淡黄色的上层血浆,分装于1.5毫升的离心管中,-20度冷冻保存备用。
2.
将上述血细胞样品转移至一50毫升的离心管中,加入红细胞裂解液30毫升,翻转混匀多次,37度恒温水浴15-30分钟。4500rpm离心10分钟,去除上层破碎的红细胞上清液,保留底部白色白细胞沉淀。
3.
再加入10毫升红细胞裂解液重复上述步骤一次,以充分去除红细胞。
4.
在振荡器上充分振荡至底部沉淀消失。
5.
加蛋白酶K
50微升(浓度20毫克/毫升)。
6.
再加入10毫升白细胞裂解液,用塑料吸管充分抽打至溶液无稠性,37度水浴15-30分钟。
7.
放入-20度冰箱或冰浴5分钟,加入冷却的蛋白沉淀剂3.3毫升,高速振荡1分钟,4500rpm离心10分钟,此时可见底部有褐色沉淀。
8.
另取一干净50毫升离心管,加入10毫升异丙醇,将上述上清液转移至其中,轻轻摇动,即可见或多或少的云絮状DNA漂浮物。
9.
4500rpm离心15分钟或更长时间,小心弃去上清,避免将DNA倒出,加2毫升75%乙醇,4500rpm离心15分钟,保留沉淀。
10.
室温下干燥DNA,加1毫升TE溶解DNA,放在4度恒温摇床中
中速振摇24-48小时。
11.
取10微升DNA溶液于1990微升双蒸水中,测定其在260nm和280nm处的吸光度值,计算DNA纯度与浓度。(DNA含量=A260×10mg/ml)
12.
将DNA等量分装两份于1.5毫升EP管中,-20度保存备用。
用资料本记录各种数据
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