实验一  人类外周血淋巴细胞培养

一、实验目的

1. 掌握人类外周血细胞培养的原理。

2. 学习人类外周血淋巴细胞的培养方法。

二、实验原理

通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂细胞的，只有在异常情况下才能发现。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。体外培养时经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，T淋巴细胞可转变为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时（三个周期）的短期培养，即可产生大量的增殖期细胞群。用秋水仙素（细胞分裂阻断剂）积累分裂相，可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期，从而获得足够的可供分析的中期分裂相。

三、实验准备

1. 实验器材：

超净工作台、37℃恒温培养箱、酒精灯、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、止血带、离心机、定时钟、试管架、 手术镊子

2.实验材料：

人外周静脉血（肝素抗凝）

3.试剂

抗凝剂：肝素溶液（500U/ml）

 培养基：RPMI1640, 按照说明书配制后抽滤、分装，冻存备用。

    小牛血清：市售，冰冻保存，用时在56℃水浴条件灭活。

     植物血球凝集素（PHA）：市售，按说明书要求使用

     抗菌素：青霉素：50000U/ml，链霉素：50000ug/ml，均用无菌生理盐水配制。培养液中的终浓度均为100 U/ml

 5%NaHCO₃

四、实验步骤

（一）培养液配制（在超静工作台内无菌操作）；

每个培养瓶（容积30ml）中加入5ml培养液，其中含：

RPMI1640     4ml

灭活小牛血清  1ml

PHA          2.5mg

青霉素        500U

链霉素        500ug

依次将上述试剂加入培养瓶中，反复吹打使其混合均匀，用5%NaHCO₃调节培养基的pH值至7.2-7.4。

（二）血样本的采集：先以碘酒和75%乙醇消毒皮肤。用2ml灭菌注射器吸取约0.2ml肝素,作静脉穿刺，抽取外周静脉血1ml。转动针筒以混匀肝素

（三）接种：常规消毒后，立即将针头插入灭菌小瓶内，送入超净工作台 ，在火焰旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（6号针头45度倾斜，约20滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。贴好标签，将培养瓶放在37℃恒温箱内静置培养72h。

五．注意事项

1. PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。

2．培养箱的温度应控制在37±0.5℃，温度过高或过低均会影响细胞生长。

3.培养基的pH值应该在7.2-7.4左右，低了细胞生长不良，高了细胞则会出现轻度的固缩。

六．思考题

1. 结合自己的实验操作，总结一下全血培养过程的要点，有哪些需要特别注意的问题？

2.在外周血培养过程中，加入植物血凝素的作用是什么？

                                                          (刘奇迹 陈丙玺)