DNA分子复制有关延伸资料

1.关于DNA分子复制的早期推测

关于DNA分子是如何复制的，在早期的研究中，科学家们提出了三个模型，它们是全保留复制模型（conservative model）、弥散复制模型（dispersive model）和半保留复制模型（semiconservative model）。这里我们主要介绍全保留复制模型和弥散复制模型。

（1）全保留复制模型  在全保留复制模型中，母链DNA分开，分别复制形成两条子链DNA，此后两条母链DNA彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链DNA分子（图26）。

http://biobar.hbhcgz.cn/Article/UploadFiles/200707/20077717310961.jpg图26 DNA分子复制模型

（2）弥散复制模型  在弥散（分散）复制模型中，亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可以作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”。

2．复制的概念

DNA合成进行时，以两条亲代DNA链中的每一条链为模板，在DNA依赖的DNA聚合酶催化下，按A与T、G与C碱基配对原则合成子代DNA的过程称DNA的复制。由于复制合成的子代DNA两条脱氧核糖核苷酸链中有一条来自亲代DNA，另一条是以前者为模板新合成的子代DNA链，所以DNA的这种合成作用又称半保留复制。

参与复制的酶类有：①DNA聚合酶（依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA pol）。原核生物的DNA聚合酶有DNA pol I，II，III，其中DNA pol III是真正起复制作用的酶，DNA pol I有校读、填补空隙、修复等功能。真核生物有DNA pol α、β、γ、δ、ε，其中DNA polα和δ是主要复制酶。②解链酶类，包括解螺旋酶（DnaB蛋白），消耗ATP解开DNA双链。单链DNA结合蛋白（SSB）维持模板单链状态及保护单链完整。③拓扑异构酶，有I型和II型两种。I型切断DNA单链，II型切断DNA双链，再松弛双螺旋后又重新连接切口（II型需消耗ATP能量），松解DNA的打结、缠绕、连环等现象，理顺DNA链以配合复制进程。④引物酶，参与组成引发体催化合成RNA引物，以延长DNA新链。⑤DNA连接酶，催化两段相邻的DNA链的3′-OH和5′-P形成磷酸二酯键而连接成完整链。

3.DNA分子的复制

DNA复制的最主要特点是半保留复制、半不连续复制（图27）。在复制过程中，原来双螺旋的两条链并没有被破坏，它们分成单独的链，每一条旧链作为模板再合成一条新链，这样在新合成的两个双螺旋分子中，一条链是旧的而另外一条链是新的，因此这种复制方式被称为半保留复制。

DNA双螺旋的两条链是反向平行的，一条是5′→3′方向，另一条是3′→5′方向。在复制起点处，两条链解开形成复制泡（replication bubble），DNA向两侧复制形成两个复制叉（replication fork）。随着DNA双螺旋的不断解旋，两条链变成单链形式，可以作为模板合成新的互补链。但是，生物细胞内所有的DNA聚合酶都只能催化5′→3′延伸。因此，以3′→5′的链为模板链时，DNA聚合酶可以沿5′→3′的方向合成互补的新链，这条链称为前导链（leading strand）。当以另一条链为模板时则不能连续合成新链，被称为滞后链（lagging strand）。这时，DNA聚合酶从复制叉的位置开始向远离复制叉的方向合成大约1~2 kb的新链片段，待复制叉向前移动相应的距离后，又重复这一过程，合成另一个类似大小的新链片段，这些片段被称为冈崎片段（Okazaki fragment）。最后，由一种DNA聚合酶和DNA连接酶负责把这些冈崎片段之间的RNA引物除去，并把缺口补平，使冈崎片段连成完整的DNA链。这种前导链的连续复制和滞后链的不连续复制在生物细胞中是普遍存在的，称为DNA合成的半不连续复制。

http://biobar.hbhcgz.cn/Article/UploadFiles/200707/20077717314417.jpg图27 DNA分子的复制

（1）参与DNA复制的物质

DNA的复制是一个复杂的过程，需要DNA模板、合成原料──三磷酸核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、酶和蛋白质等多种物质的参与。

解旋酶（helicase）  DNA复制涉及的第一个问题就是DNA两条链要在复制叉位置解开。DNA双螺旋并不会自动解旋，细胞中有一类特殊的蛋白质可以促使DNA在复制叉处打开，这就是解旋酶。解旋酶可以和单链DNA以及ATP结合，利用ATP分解生成ADP时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开。

单链DNA结合蛋白（SSB）  解旋酶沿复制叉方向向前推进产生了一段单链区，但是这种单链DNA极不稳定，很快就会重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解。在细胞内有大量单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein，SSB），能很快地和单链DNA结合，防止其重新配对或降解。SSB结合到单链DNA上之后，使DNA呈伸展状态，有利于复制的进行。当新DNA链合成到某一位置时，该处的SSB便会脱落，可以重复利用。

DNA拓补异构酶（DNA topoisomerase）  DNA在细胞内往往以超螺旋状态存在，DNA拓补异构酶催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变。DNA拓补异构酶有两类。DNA拓补异构酶I的作用是暂时切断一条DNA链，形成酶—DNA共价中间物，使超螺旋DNA松弛，再将切断的单链DNA连接起来，不需要任何辅助因子，如大肠杆菌的ε蛋白；DNA拓补异构酶Ⅱ能将负超螺旋引入DNA分子，该酶能暂时性地切断和重新连接双链DNA，同时需要ATP水解提供能量，如大肠杆菌中的DNA旋转酶（DNA gyrase）。

引物酶（primase）  引物酶在复制起点处合成RNA引物，引发DNA的复制。它与RNA聚合酶的区别在于可以催化核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的聚合，而RNA聚合酶只能催化核糖核苷酸的聚合，其功能是启动DNA转录合成RNA，将遗传信息由DNA传递到RNA。

DNA聚合酶（DNA polymerase）  DNA聚合酶最早是在大肠杆菌中发现的，以后陆续在其他原核生物中找到。它们的共同性质是：以dNTP为前体催化DNA合成；需要模板和引物的存在；不能起始合成新的DNA链；催化dNTP加到生长中的DNA链的3′-OH末端；催化DNA合成的方向是5′→3′。

DNA连接酶（DNA ligase）  DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5′磷酸基团的末端与另一DNA链的3′-OH生成磷酸二酯键。只有两条紧邻的DNA链才能被DNA连接酶催化连接。

（2）DNA复制的引发

所有DNA的复制都是从固定起始点开始的，而目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链，那么一个新DNA的复制是怎样开始的呢？研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA引物3′端开始合成新的DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。但对于滞后链来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。

滞后链的引发过程通常由引发体（primosome）来完成。引发体由6种蛋白质共同组成，只有当引发前体与引物酶（primase）组装成引发体后才能发挥其功效。引发体可以在滞后链分叉的方向上移动，并在模板上断断续续地引发生成滞后链的引物RNA。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，长度一般只有3～5个核苷酸。

在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置上才能合成RNA引物。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶I切除，以提高DNA复制的准确性。

RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补配对原则加在RNA引物3′-OH端而进入DNA链的延伸阶段。

（3）DNA链的延伸

DNA新链的延伸由DNA聚合酶Ⅲ所催化。为了复制的不断进行，DNA解旋酶须沿着模板前进，边移动边解开双链。由于DNA的解链，在DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状DNA中更为明显，当达到一定程度后就可能造成复制叉难以再继续前进，但在细胞内DNA的复制不会因出现拓扑学问题而停止，因为拓扑异构酶会解决这一问题。

随着引发体合成RNA引物，DNA聚合酶Ⅲ全酶开始不断将引物延伸，合成DNA。DNA聚合酶Ⅲ全酶是一个多亚基复合二聚体，一个单体用于前导链的合成，另一个用于滞后链的合成，因此它可以在同一时间分别复制DNA前导链和滞后链。虽然DNA前导链和滞后链复制的方向不同，但如果滞后链模板环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通过DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向未解链的双链DNA的方向上，则滞后链的合成可以和前导链合成在同一方向上进行。

当DNA聚合酶Ⅲ沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸，合成DNA。当合成的DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片段从DNA聚合酶Ⅲ上释放出来。由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕DNA聚合酶Ⅲ全酶，通过DNA聚合酶Ⅲ开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这种机制，前导链的合成不会超过滞后链太多，这样引发体在DNA链上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移动。在复制叉附近，形成了以DNA聚合酶Ⅲ全酶二聚体、引发体和解旋酶构成的类似核糖体大小的以物理方式结合成的复合体，称为DNA复制体。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链以及由许多冈崎片段组成的滞后链。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶I通过其5′→3′外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，并利用后一个冈崎片段作为引物由5′→3′合成DNA填补缺口。最后由DNA连接酶将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA滞后链。

4．DNA复制过程

真核生物的DNA复制过程与原核基本相似，有些机制尚不十分清楚。根据目前认识，可将ECOHDNA复制过程（如下图）分为以下阶段。

http://www.med999.net/d/file/yishi/test/test83/2010-03-05/3747d8a8984bcdd13b8d7fce533bff05.jpg

（1）螺旋的松弛与解链：在复制起始点ori所在部位首先由DNA拓扑异构酶(Topo)和解链酶松弛DNA超螺旋结构，解开一段双链，并由单链DNA结合蛋白(SSB)保护和稳定DNA单链，形成复制点。这个复制点的形状像一个叉子，即复制叉，将模板展示出来。

（2）引物RNA的合成：当两股单链暴露出足够数量的碱基对时，DNA复制即进入引发阶段，主要由引发酶和引发前体参与合成RNA引物。以3′→5′走向的亲代DNA链为模板进行合成的子链，称前导链；以5′→3′，走向的亲代DNA链为模板进行合成的子链，称随从链。前导链的引发较简单，在引发酶催化下合成一个短的RNA引物(10～60nt)，继而从RNA引物的3′末端开始连续地沿着5′→3′方向进行DNA链的合成。随从链引物的合成则是在引发酶和引发前体，以及血础蛋白联合作用下合成的。继而在引物的3′→OH端进行冈崎片段的合成。

（3）DNA链的延长：DNA链的延长是在DNA聚合酶(DNA pol)催化下，以四种三磷酸脱氧核苷(dNTP)即dATP、dGTP、dCTP和dTTP为原料进行的聚合反应。反应体系中有DNA模板、引物及Mg2+.存在。聚合作用是自引物的3′→OH端上开始，从5′→3′方向逐个加入脱氧核背酸dNMP而脱下焦磷酸PPi，使DNA链得以延长。复制时DNA的两条链均可作为模板，分别合成两条子代DNA链。由于DNA的两条链是反平行的，即一条链走向是5′→3′，而另一条链是3′→5′走向，但是DNA pol催化DNA链的合成只能G着5′→3′方向进行，因此解开双链后在3′→5′走向的模板上可以顺利地按5′→3′方向合成新的DNA链，即前导链；而以5′→3′走向链为模板、仍然按5′→3′方向合成只能是不连续的短DNA片段(冈崎片段)。

（4）终止：DNA片段合成至一定长度后，链中的圃帖引物即被核酸酶水解而切掉。此时出现的缺口由DNA的继续延长而填补，然后由DNA连接酶将这些片段再连接起来，形成完整的DNA链。E coli DNA的复制叉复制过程如上图。

DNA复制完毕后，DNA Topo将DNA分子引入超螺旋结构，进行进一步的装配。真核生物DNA的复制特点是：多个起始点同时进行复制。复制基本过程与原核生物相似，但蛋白质体系更为复杂。DNA polα和δ是主要复制酶。真核生物染色体线性DNA复制后，最后复制的RNA引物水解后空隙的填补需要端粒酶的作用。端粒酶存在于真核染色体端区，为RNA核蛋白复合体，有反转录酶活性，可以自身RNA为模板反转录合成延长染色体端区重复序列的端粒DNA，维持染色体DNA信息的完整，防止缩短。