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从胶上回收蛋白的方法
(2007-11-18 10:36:22)| 分类： 蛋白质技术 |
1.电泳后进行非固定染色，即使用no-methanol的考马斯亮蓝染色液，具体：SDS-PAGE电泳缓冲液中加入适量考马斯亮蓝粉末摇匀后加入gel进行染色，大约30分钟到一小时，尽量不要超过一个小时，过长会使蛋白质损失，可在染色时注意观察，如可看见目的条带即可进行脱色，脱色液使用电泳缓冲液即可。脱色时间大概30分钟到一个小时，一般30分钟即可看见清晰条带。
2.切下目的条带，可以继续实验，也可以用保鲜膜包好，标记时间，名称后放入负80度冰箱冻存，冻存时间不宜过长，最好一周内即进行实验，再次实验时，on ice gel解冻。
3.Electroelution into membrane traps from gel slices. gel切成slices后放入dialysis memebrane中，加入电泳缓冲液，用量：150ul-300ul/well，well即电泳时上样孔数。电洗脱使用SDS电泳缓冲液，洗脱电泳槽即使用水平电泳槽，电压50-100伏特，根据蛋白性质，大小，时间1.5小时到3小时，每半小时更换电流方向5分钟。
4.Dialysis after electroelution.In cold room,4度低温室，300-500ml透析液，1小时或2小时更换一次，时间4小时或O/N.透析液可使用10倍稀释的电泳缓冲液或使用中性缓冲液，比如PBS等。
5.Store.微量移液器吸出透析袋中的液体部分，估计液体量，装入EP tube,另取出少量，大约1/10量，蛋白定量用并估算回收率。其它加入4倍体积EtOH,充分混匀，可看到蛋白沉淀。用于定量的sample也要乙醇沉淀。负80度冰箱冻存，备用。
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