实验目的：

掌握一种快速提取RNA的方法。Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

实验准备：

焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。闻起来香香甜甜的，但却是一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂。开瓶时将瓶子远离你，用注射器从瓶塞插入取液，因内压可导致溅泼。操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行。

TRIzol试剂：对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。

1、配制DEPC水：在0.2umol膜过滤的重蒸水中加入DEPC（焦碳酸二乙酯）至终浓度0.1％，搅拌器上搅拌3hr，后37℃过夜。高压灭菌30min

2、所有的玻璃器皿均应在使用前，用锡纸包住，于180℃的高温下干烤6hr或更长时间，烘烤完毕，关电源，待冷却后取出，并将锡纸封紧。

3、塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。

4、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H₂O₂ 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。

5、配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。

实验原理：

（1）TRIzol的主要成分是酚。主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。

x0.1%的8－羟基喹啉的，与氯仿联合使用可增强对RNase的抑制

x异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。

xβ-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。

（2）氯仿可以使蛋白变性，降低蛋白的溶解度。加入氯仿，虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）。氯仿还可以去除植物色素和蔗糖。同时，氯仿可以去除核酸溶液中的痕量的酚。

（3）异丙醇是沉淀RNA的，降低了RNA在氯仿中的溶解度。异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。但是异丙醇难以挥发出去。

（4）因为这些试剂都会影响后续实验，所以用酒精洗一到两遍。一是酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质，二是洗掉异丙醇、氯仿，酒精的易挥发性在这里得到运用，痕量的乙醇很容易挥发掉。

试验步骤：

1. 称取0.1g新鲜的样品放入用液氮预冷的研钵中，边加液氮边研磨至细粉状（对于体壁较硬的组织可加入石英砂一起研磨）

2. 迅速用药匙取研磨好的细粉加入到含1ml TRizol的离心管中（以50-100mg组织加入1ml Trizol液，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%）

3. 立即用振荡器振荡2min使之快速溶解于裂解液之中

4. 室温10min 期间不断振荡，让组织充分裂解

5. 静止数秒

6. 4℃ 12000rpm 离心5min（目的是去除虫体残渣）

7. 取200ul 氯仿于新的离心管，取上一步上清液迅速加入，快速振荡2min（以每1ml Trizol液加入200ul 的比例加入氯仿）

8. 室温5min 期间不断振荡

9. 室温静置2min

10. 4℃ 12000 rpm 离心10 min

11. 取200ul 氯仿于新的离心管，取上一步上清液迅速加入，快速振荡15s

12. 4℃ 12000 rpm 离心10 min

13. 取500ul 异丙醇于新的离心管，取上一步上清液迅速加入，缓慢颠倒离心管。（按每1ml Trizol液加500ul异丙醇的比例加入异丙醇）

14. －20℃沉淀过夜或－80℃沉淀1hr。（也可室温20min）

1. 将含有RNA沉淀的离心管从冰柜中取出

2. 4℃ 12000 rpm 离心10 min

3. 小心弃上清

4. 加入1ml 75％ EtOH

5. 缓慢颠倒离心管，小心弃上清

6. 加入1ml 75％ EtOH

7. 振荡器振荡使沉淀悬浮

8. 4℃ 7500 rpm 离心5 min

9. 小心弃上清

10. 短暂离心,40ul 枪吸去剩余上清

11. 超净台中自然干燥2min

12. 加入16ulDEPC 处理的重蒸水溶解

思考题：

1. TRIzol的主要成分及其作用是什么？

2. 详细列出实验中有那些需要注意的事项关系到RNA的产量？

跟学生强调：

1. 戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换（我们做不到勤换，要做到带手套的手不要乱摸其它东西），并尽可能在低温下操作。

2. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。我们条件有限，实验前请同学们清理干净试验台，将台面等用酒精棉擦拭干净，实验过程中不要跑动，尽量少说话。

3. 为了保证提取RNA的质量，操作过程中每步取液要迅速，加完液迅速盖离心管盖，振荡。因大家共用枪头、试剂，取枪头、试剂要迅速，取完盖盖。

4. 由于试剂有毒，用完的离心管要盖盖后丢弃

5. 关于提取RNA组织样品的保存：加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。