抗菌药物对预防或治疗动物疾病发挥了巨大的作用，但随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用，尤其为了防治疾病，常常以亚剂量水平的药物添加于饲料中，以致长期使用后病原微生物产生了耐药性，使本来对治疗病原微生物感染有效的抗菌药物失去作用，给兽医临床上有效地预防和治疗疾病的发生带来一定的困难。通过制作自家药敏纸片进行试验,可快速进行药物的筛选,获得对病原微生物敏感的药物, 对指导临床合理用药，提高治疗效果，节约养殖过程的用药费用，有着重要的意义。

一.    药敏纸片的制备

1.     材料

   抗菌药物、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰醋酸、新华1号定性滤纸、50mL容量瓶、无菌过滤器或一次性过滤器等

2．方法

2.1 PBS的配制

A.制备0.2mol/L储备液

  0.2mol/LNa₂HPO₄ ： 35.61g Na₂HPO₄.2H₂O+1000 mL蒸馏水

                  或71.62g Na₂HPO₄.12H₂O+1000 mL蒸馏水

  0.2mol/L NaH₂PO₄ :31.2g NaH₂PO₄.2H₂O+1000 mL蒸馏水

                   或27.6g NaH₂PO₄.H₂O+1000 mL蒸馏水

B.将两种储备液按下表比例，配制成不同pH值的PBS,室温保存备用

0.2mol/L磷酸缓冲液的配制

pH值	0.2mol/LNa2HPO4(mL)	0.2mol/L NaH2PO4(mL)
5.8	8.0	92.0
6.0	12.3	87.7
6.2	18.5	81.5
6.4	26.5	73.5
6.6	37.5	62.5
6.8	49.0	51.0
7.0	61.0	39.0
7.2	72.0	28.0
7.4	81.0	19.0
7.6	87.0	13.0
7.8	91.5	8.5
8.0	94.5	5.5

2.2 抗菌药物原液的配制和保存期限

2.2.1抗菌药物配制溶剂和保存期限

2.2.2 配制方法

A.按抗菌药物原液中药物百分含量的要求，计算出纯抗菌药物的重量，方法是：抗菌药物终浓度×终体积。例：要配制１２８０mg/mL 的庆大霉素５０毫升，所需要的纯抗菌药物质量为１２８０ ×５０＝６４０００ mg

B.根据纯抗菌药物的重量和抗菌药物原粉的百分比计算出所需抗菌药物原粉的重量，方法是：纯抗菌药物的质量÷抗菌药物原粉的百分含量。如:某庆大霉素原粉的含水量为4.19％，则需要庆大霉素原粉的质量为64000÷（1－ 4.19％） ＝6.68×104 mg=66.8mg=0.0668g

C.各种抗菌药物按上述表进行溶解后定容。

D.无菌条件下过滤，4℃保存备用。

2.3 药敏纸片的制备

2.3.1空白纸片的制备

用打孔机将制作直径为6毫米左右的圆形滤纸，按50张一份，将制作好的滤纸分装到小西林瓶里，用牛皮纸封瓶口进行高压（121℃，15min）,烘干备用。

2.3.2 抗菌药纸片的制备

不同细菌对不同抗菌药纸片的药物含量要求标准

A.根据不同药物药敏纸片的药物含量要求，计算出50片药敏纸片需要的药物总含量，方法是：５０×每张药敏纸片的含药量。如：制备一份（５０片）含药量为１０mg的庆大霉素 ，所需的抗菌药物总质量为５０ × １０ ＝5００ mg

B.药物总含量除以抗菌药物原液的浓度，得出50片药敏纸片需要的抗菌药物原液的总体积，抗菌药物总质量÷抗菌药物原液浓度。如：制备一份庆大霉素药敏纸片所需的抗菌药物原液的体积是5００÷１２８０＝０．390625mＬ即390.625mＬ

C.在无菌条件下，将各抗菌原液加入装有纸片的小西林瓶中，用纸密封瓶口。

D.置西林瓶37℃烘箱，将含药物的纸片烘干。

E.在无菌条件下，取一片烘干后的药敏纸片加入到灭菌的肉汤中，检查是否有细菌污染，并用西林瓶盖将西林瓶密封，并置4℃保存。

F.16小时后观察是否有细菌污染，将有污染的药敏纸片剔除，并重新再做；无污染的可用作纸片扩散法。

3.注意事项

⑴配抗菌药物原液前要清楚抗菌药物原粉的百分含量、批号和生产厂家。

⑵配制抗菌药物原液时，可能会遇到抗菌药物难溶的现象，这就要求用相应的助溶剂溶解。

⑶抗菌药物原液的终体积要用容量瓶定容。

⑷单位的换算（如 强力霉素，含量887IU/mg，计算配制１２８０mg/mL 的强力霉素５０毫升，需要多少克强力霉素原粉？）

抗生素的效价通常以重量或国际单位（IU)来表示。

青霉钠1mg=1667 IU或1 IU＝0.6 mg

青霉素钾1mg=1559 IU或1 IU＝0.625 mg

制霉菌素1mg=3700 IU

其他抗生素多以重量为单位或1mg=1000 IU

⑸抗菌药物原液的终浓度可增大到5120mg/mL，这可缩减加入纸片中的抗菌药物原液的体积。

⑹根据标准，有时要求纸片的抗菌药物含量较低，加入的抗菌药物原液的量过少，不足以将50片纸片全部润湿时，应将抗菌药物原液用相应的灭菌PBS稀释到0.5mL，混匀后再加入西林瓶内。

⑺制作纸片时，要多做几份进行高压，以备试验失败重做时，节约时间。

⑻药敏纸片在37℃烘干，可能需要一到两天的时间，切勿将纸片放入高温中烘干，以防药物失效。

⑼密封纸片后，可放入4冰箱保存或置阴暗干燥处保存，切勿受潮。

 

 

 

二. 药敏试验方法

常用的药物敏感试验有纸片法，试管法、挖洞法、挖沟法、琼脂稀释法和泡沫塑料片法，纸片法是生产中常用的药敏试验方法，具有简便、易行、出结果快的特点，适合于基层实验室开展。

1材料

普通琼脂、营养肉汤、药敏纸片（自制）、灭菌试管、灭菌棉拭和镊子、被试细菌、灭菌生理盐水

2 方法

A.挑取单菌落接种于3mL营养肉汤中，37℃ 培养16小时。

B.用无菌生理盐水将培养好的菌液做1:20稀释。

C.用无菌棉拭蘸取稀释过的菌液，在试管壁上挤去多余液体，涂于营养琼脂表面，每次旋转平板60度，共涂3次，使整个平板涂布均匀，分别涂布两块平板。

D.平板放置3～5分钟后，用无菌镊子取药敏纸片，贴于一平板表面，并轻压一下纸片，使其贴平，纸片间相距3mm左右。

E.于另一平板上，平均划分为6个区域，并在每个区域中贴同样的药敏纸片。

F.37培养16～18小时，用尺子量取抑菌圈的直径3次，计算其平均值即为试验结果。另一方面，量取贴有同样纸片的平板上的抑菌圈的直径，看直径大小是否一致，检查所做的药敏纸片的含药量是否一致。

3 结果判断

结果判定可参照以下标准

 

4.注意事项

⑴严格控制细菌培养的时间，以防过多的细菌而影响试验结果的可靠性。

⑵涂布已稀释的菌液时，切勿将棉拭挤压过干，要保证有足够的菌量。

⑶涂布前，可用记号笔将平板平分为六个区域，以便进行涂布。

⑷涂布时，注意用力不能太大，切勿将琼脂破坏。

⑸把纸片平贴于培养基后，应将平板倒置放入培养箱中培养。