一、 原理与实验

1．1 电泳亲和色谱分离原理
　 电泳亲和色谱的分离原理如图1所示。分离过程在由膜隔开的多通道电泳槽中进行，电场方向与各腔室中的溶液流动方向垂直。带不同电荷的蛋白质混合物进入进样室，带电的目标组分在电场作用下迁移进入介质室，被亲和介质吸附。带电性质与目标组分相近的杂质蛋白在电场作用下通过介质室，继续迁移进入冲洗室并被冲洗溶液带出；而带电性质与目标组分相反的杂质蛋白质在电场作用下直接迁移进入另一侧的冲洗室，然后被冲洗液带出，减少了杂质蛋白质在介质中的非特异性吸附，从而提高了分离过程的选择性。吸附完成后，引入洗脱缓冲溶液，在电场作用下将目标组分从介质上洗脱下来，并迁移入冲洗室被冲出，完成分离过程。
1．2 电泳亲和色谱装置
电泳亲和色谱装置为6腔室结构的电泳槽，各腔室间用膜隔开，如图2所示。电极室与冲洗室之间用自行合成的lmm厚的凝胶膜８隔开；冲洗室、介质室及进样室之间用HT Tuffryn 450膜隔开。各腔室的长度均为12cm，宽度增为12cm，阳极室、阴极室、阳极冲洗室、阴极冲洗室、进样室和介质室的厚度分别为４.０、4.0、3.0、４.０、3.0和4.5mm。采用铂丝作为电泳槽的阳极和阴极。
1．3 实验方法
实验时，首先用泵将吸附缓冲溶液连续输入电极室、冲洗室和进样室，然后开启电泳仪电源。当亲和介质与吸附缓冲溶液达到平衡后，将含蛋白质的样品缓冲溶液泵入进样室，开始电泳吸附。电泳吸附过程持续约60min后，进行15min左右的电泳淋洗。之后关闭电泳仪电源，将缓冲溶液更换为洗脱缓冲溶液，再打开电泳仪电源，进行电泳洗脱。实验结束后，用6moL／L尿素再生介质。
1．4 试剂
实验用的亲和介质BIue Sepharose 6 FastFlow(TM)，其配体为Cibacron Blue F3G-A,,可与HSA产生亲和作用；HT TuffrynTM450膜材料为亲水聚砚，孔径为0.45 μm，厚度为165 μm。Tris-三(羟甲基)氨基甲烷、丙烯酰胺和TEMED[X，N，N；N’—四甲基乙二胺]；甘氨酸和HEPES[N—双(2—羟乙基)哌嗪-N’-2-乙磺酸]；甲*丙烯酰胺；HAS。其余试剂均为分析纯。
1．5 产品测定方法
采用紫外—可见分光光度计测量溶液中的HSA的浓度，检测波长为280 nm，HSA的吸光系数为0．53m2／kg。

二. 结果与讨论

2．1 电流强度对电源亲和吸附的影响
电泳亲和吸附实验的电泳过程均采用恒电流操作，可消除电极室生成的气泡对冲洗室和介质室中的电场的影响，便于在冲洗室和介质室中获得稳定的电场强度。同时采用交变电场技术，通过施加短时间的反向电压减少蛋白质对膜的污染6，所有实验中正向电压周期均为3min，反向电压周期为2s。在以HSA—Blue介质模式体系进行研究时，HSA的等电点为4.9，实验中电泳操作的缓冲溶液pH值均高于4.9，HSA始终带负电荷，且体系中不存在其他杂蛋白，故将阴极冲洗室拆除以简化设备的安装与维护。吸附缓冲溶液为0.002mol／L HEPES—Tris，pH值7.5，电导率为100 μ s／cm。
在不同的电流强度下进行亲和吸附，实验时分别测定进样室、冲洗室出口的HSA浓度，通过质量衡算得到HSA在Blue介质上的吸附过程曲线，如图3所示。计算吸附容量，得出Blue介质对HSA的吸附容量与电流强度的关系，如图4所示。
从图3、4中可知，电流强度对吸附过程和吸附容量的影响呈现相似的规律：当电流强度从10 mA 增至20mA时，Blue介质对HSA的吸附速度及吸附容量随电流强度的增大而迅速增加。而当电流强度高于20mA时，继续提高电流强度，Blue介质对HSA的吸附速度及吸附容量基本不受电流强度的影响。图3的结果表明，在电流强度低于20mA的实验条件下，HSA扩散进入介质层的过程是亲和吸附过程的速度控制步骤，因而提高电流强度可使HSA的扩散过程大大加速。在电流强度高于20mA的实验条件下，吸附过程已由扩散过程控制转为质量置换反应速度控制，吸附反应速度由亲和力决定，因而受电流强度的影响不大。在电泳亲和吸附的实验条件下，电场力远弱于与配基和目标组分间的亲和吸附力，因而电流强度对吸附容量影响不大，这与Yarmush和Olson的结论是一致外的。当电流强度为10mA时，吸附容量较小是由于此时扩散阻力很大，Blue介质与HSA的吸附远未接近平衡造成的。
2．2 电场对电泳洗脱的影响
本文将化学洗脱与电泳洗脱相结合，进行洗脱条件优化。为此，首先考察了Blue介质对HSA的饱和吸附容量与缓冲溶液组成的关系，以选择合适的洗脱缓冲溶液，结果如表1所示。
表1的结果表明当pH高于8.5时，HSA饱和吸附容量骤降。因此采用0.01mol/L Tris-GIy,pH值8.8，电导率为90μ s／cm的缓冲溶液作为洗脱缓冲溶液进行电泳洗脱实验。这部分实验中的吸附操作在无电场下进行，采用0.01mol/L HAc-NaAc，PH 4.2的溶液作为吸附缓冲溶液，在此强吸附条件下考察电场对洗脱过程的影响更为适宜。
电泳实验采用恒电流操作，得到在不同的电流强度下的洗脱曲线如图5所示。由图5可知，在电场下的解吸过程具有类似的动力学特征，即均有开始时的高速解吸阶段转向后期的均匀低速解吸阶段。电流强度对解吸过程有非常显著的影响，尤其是在洗脱的初始阶段，洗脱速度随电流强度的提高而大大加快。在本文所述的实验中，最大洗脱产量可达到平均30 mg／h。远远高出现有文献所报道的其他类型的电泳洗脱方法的结果(通常低于1mg/h)，显示出该方法在较大规模亲和色谱分离过程中的良好应用前景。
2．3 电泳亲和色谱分离人血清清蛋白
为证明该方法的可行性，在电场下完成电泳吸附及电泳洗脱过程，吸附操作采用的缓冲溶液为0.002mol/L HEPES-Tris,PH=7.5，电导率为100 μs／cm，电流强度为60mA。洗脱操作采用的缓冲溶液为0.01mol/L Tris-Gly，PH＝8.8，电导率为75μs／CM，电流强度为40mA。分离过程中BLue介质中HSA的含量随时间的变化如图6所示。由图6可知，吸附过程在49min结束，吸附容量为(HSA／gel)6.07mg／ml，淋洗过程在15min结束。洗脱过程在108min结束，洗脱速度为16.8mgHSA／h，电泳洗脱过程中HSA的回收率为92.3％。

二、 结论

本文研究结果表明，利用电场可加速亲和色谱分离过程中的吸附与解吸速度，进而提高整个分离过程速度。在吸附过程中，电场对于亲和介质饱和吸附容量及吸附速度的影响不大；在洗脱过程中，洗脱速度随电流强度的变化有显著变化，获得的电泳洗脱速度远远高于文献报道结果，显示出电泳亲和色谱在大规模生物制品分离中的良好应用前景。