加载中…
提取大肠杆菌质粒DNA和染色体DNA的实验步骤
(2006-09-29 12:02:56)| 分类： 专业知识 |
1 沸水浴法快抽大肠杆菌质粒DNA
(1)在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15 000rpm离心15分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇(注意不同样品管中的溶液平衡),充分混匀后15 000rpm离心15分钟.
(5)弃上清液,沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得DNA样品,完毕后弃上清,管子倒扣10S左右,然后将DNA沉淀凉干.
(6)沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解,样品可取5ml酶切电泳分析或待用.
2 碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA
(1)取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中,于台式高速离心机中以15 000rpm,常温离心30秒,弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上.(4管/组)
(2)在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体,涡旋振荡,以充分悬浮菌体成均匀悬浮液.
(3)加入200ml溶液II,扣上离心管盖,立即轻轻混匀(来回颠倒数次),至溶液几乎澄清,成淡黄色透明粘液状.
(4)打开离心管盖,加入150ml溶液III,轻轻混匀(来回颠倒数次),看到淡黄色消失,有大量白色沉淀生成,然后离心.
(5)常温15 000rpm离心10分钟,小心吸取上清液于另一离心管中.注意,不要把白色絮状物混入上清液中.
(6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15 000rpm离心10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不要将下层有机相混入上清液中.
(7)在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml,充分混匀,常温15 000 rpm离心10分钟.
(8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml 75%的冰乙醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干.
(9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37℃保温5~10分钟.(100ml/管,4管)
(10)合并于一管,加入2ml RNase,37℃保温30分钟,取5ml电泳检查消化彻底否.(以电泳前端无RNA条带为准)
(11)RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各300ml),充分混匀,4℃,15 000rpm离心15分钟,将上清液转移至另一离心管.
(12)在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M, pH5.5 KAc(约40ml),400ml的–20℃冷冻的异丙醇,充分混匀,4℃,15 000 rpm离心20分钟.
(13)用400ml 75%的冰乙醇洗涤一次,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干,待用.
(14)如需定量或检测制备的质粒DNA的质量,可取适量质粒DNA进行适当稀释,测定OD260nm和OD280nm值,计算OD260nm/OD280nm的比值.质粒双链DNA量可以1 OD260nm=50mg/ml计算.OD260nm/OD280nm应为1.8左右.
3 沸水浴制备染色体DNA
(1)在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15 000rpm离心10分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),上清待用.
4 大肠杆菌中染色体DNA的抽提
(1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后,培养物以50ml/管离心收获(8 000 rpm,5min,4℃).
(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟.
(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37℃保温30分钟澄清即可.
(4)取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml,60℃保温1小时.(染色体DNA结合蛋白的消化)
(5)取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M,混匀后冰浴30分钟(溶液要混合成为均相,并且冰浴要充分,时间可适当延长).
(6)取出后4℃,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样品管要进行平衡,以免离心机受损)
(7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混匀,室温下12,000rpm离心30分钟.
(8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟.
(9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置30分钟,15 000rpm离心30分钟.
(10)75% 冰乙醇洗涤5分钟.
(11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA,在37℃水浴中放置30分钟.
(12)用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积).
(13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于-20℃.
(1)在Eppendorf管中加入110ml的STET(使用前加入溶菌酶至终浓度为5mg/ml)溶液,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15 000rpm离心15分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),在上清液中加入100ml的异丙醇(注意不同样品管中的溶液平衡),充分混匀后15 000rpm离心15分钟.
(5)弃上清液,沿管壁四周加入70%冰乙醇400ml洗涤上述所得DNA样品,完毕后弃上清,管子倒扣10S左右,然后将DNA沉淀凉干.
(6)沉淀凉干后用50ml无菌重蒸水溶解,样品可取5ml酶切电泳分析或待用.
2 碱溶法制备大肠杆菌质粒DNA
(1)取1.5ml过夜细菌培养液于1.5ml离心管中,于台式高速离心机中以15 000rpm,常温离心30秒,弃去上清液并将离心管倒扣在滤纸上.(4管/组)
(2)在离心管中加入100ml溶液I悬浮菌体,涡旋振荡,以充分悬浮菌体成均匀悬浮液.
(3)加入200ml溶液II,扣上离心管盖,立即轻轻混匀(来回颠倒数次),至溶液几乎澄清,成淡黄色透明粘液状.
(4)打开离心管盖,加入150ml溶液III,轻轻混匀(来回颠倒数次),看到淡黄色消失,有大量白色沉淀生成,然后离心.
(5)常温15 000rpm离心10分钟,小心吸取上清液于另一离心管中.注意,不要把白色絮状物混入上清液中.
(6)清液中加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各200ml),充分混匀,常温15 000rpm离心10分钟,小心将上清液转移至另一离心管.注意不要将下层有机相混入上清液中.
(7)在上清液中加入-20℃冷冻的异丙醇600ml,充分混匀,常温15 000 rpm离心10分钟.
(8)小心倾去上清液,注意避免把离心管底的白色DNA沉淀也随同上清倒掉.加入400ml 75%的冰乙醇,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干.
(9)加入100ml无菌重蒸水溶解质粒DNA,可在37℃保温5~10分钟.(100ml/管,4管)
(10)合并于一管,加入2ml RNase,37℃保温30分钟,取5ml电泳检查消化彻底否.(以电泳前端无RNA条带为准)
(11)RNase消化完全后加入等体积的苯酚饱和溶液:氯仿混合溶液(1:1)(各300ml),充分混匀,4℃,15 000rpm离心15分钟,将上清液转移至另一离心管.
(12)在上清液中加入0.1倍溶液体积的3M, pH5.5 KAc(约40ml),400ml的–20℃冷冻的异丙醇,充分混匀,4℃,15 000 rpm离心20分钟.
(13)用400ml 75%的冰乙醇洗涤一次,再15000rpm离心1min,倾去上清,倒扣离心管于滤纸上,稍许凉干,待用.
(14)如需定量或检测制备的质粒DNA的质量,可取适量质粒DNA进行适当稀释,测定OD260nm和OD280nm值,计算OD260nm/OD280nm的比值.质粒双链DNA量可以1 OD260nm=50mg/ml计算.OD260nm/OD280nm应为1.8左右.
3 沸水浴制备染色体DNA
(1)在Eppendorf管中加入100ml的ddH2O,挑入米粒大小的菌团,充分悬浮并混匀.
(2)上述菌体悬浮液沸水煮20秒.
(3)迅速放置于常温下15 000rpm离心10分钟.
(4)用牙签挑去菌体碎片(白色沉淀),上清待用.
4 大肠杆菌中染色体DNA的抽提
(1)大肠杆菌一级瓶培养过夜,以10%的接种量接二级瓶培养4～5小时后,培养物以50ml/管离心收获(8 000 rpm,5min,4℃).
(2)菌体沉淀中加入10ml BufferA,旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟.
(3)取出后加入10% SDS至最终浓度为1%,轻轻混匀,37℃保温30分钟澄清即可.
(4)取出后加入20mg/ml的ProK至最终浓度为5mg/ml,60℃保温1小时.(染色体DNA结合蛋白的消化)
(5)取出后加入预冷的5M NaCl至最终浓度为1M,混匀后冰浴30分钟(溶液要混合成为均相,并且冰浴要充分,时间可适当延长).
(6)取出后4℃,15 000 rpm离心30分钟.(离心前样品管要进行平衡,以免离心机受损)
(7)在上清液中加入6ml苯酚和6ml氯仿混合液,混匀,室温下12,000rpm离心30分钟.
(8)在上清液中加入10ml氯仿,混匀,室温下12 000rpm离心30分钟.
(9)取上清液,加一倍量异丙醇沉淀DNA,冰浴放置30分钟,15 000rpm离心30分钟.
(10)75% 冰乙醇洗涤5分钟.
(11)晾干后,用300ml无菌双蒸水溶解染色体DNA,在37℃水浴中放置30分钟.
(12)用2～2.5体积的无水乙醇沉淀(加入pH5.5的KAc 0.1体积).
(13)沉淀洗涤,抽干后用ddH2O溶解,分装并保存于-20℃.
喜欢
0
赠金笔
前一篇：基因组DNA抽提的基本原理
后一篇：PCR的反应体系以及异常结果分析