在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在.在提取质粒过程中,除了超螺旋DNA外,还会产生其它形式的质粒DNA.如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA,简称 ocDNA);如果质粒DNA的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA).当提取的质粒DNA电泳时,同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快.
1 碱裂解法质粒DNA的抽提
主要包括3个基本步骤:裂解细胞,分离和纯化质粒DNA.
(1)裂解细胞
   基本上先加入溶菌酶作用一段时间,破壁后再加入非离子型去污剂或直接加入碱性SDS等以及作煮沸处理,以便破壁与膜,处理的同时也能去除细胞碎片,染色体DNA等杂质.非离子去污剂法较温和,适用于抽提10kb左右的质粒;而煮沸法与碱性SDS法相对较剧烈,只能抽提小于10kb的质粒.本实验采用碱性SDS法.
(2)分离
   细菌基因组均比较大,如大肠杆菌的染色体约有4700 kb长,在处理细胞过程中断裂成不同长度的双链DNA片段.当溶液的pH值调节到大于12时,双链DNA中的氢键被破坏,于是染色体DNA双链分离成单链;而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏,只是部分双链解离成单链.再将溶液的pH值调回中性时,单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子,而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子,通过离心很容易将两者分开.达到分离的目的.
(3)纯化
   细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外,还有各种细胞壁,膜的碎片,各种酶与其他蛋白质,脂质类杂质以及RNA等.纯化步骤应有针对性地将它们去除.离心去除各种细胞碎片;用酚处理去除蛋白质,包括各种酶;用RNA酶处理去除RNA等.酚是一种作用非常强烈的蛋白质变性剂,能非常有效地是蛋白质变性进而去除.氯仿有强烈的溶脂性,可去除脂质类杂质.酚/氯仿可节约重蒸酚.氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉,否则微量的酚对于以后的酶切,转化等过程都会产生不利影响.抽提完成后的水溶液中仍有痕量的酚,氯仿等,可用乙醇沉淀的方法将它们除去.乙醇沉淀的特点是能在浓缩DNA的同时更换整个缓冲系统,但DNA会有一定的损失.由于杂质不易在乙醇中沉下,沉淀过程可在0℃进行.乙醇较异丙醇易挥发,沉淀得到的DNA比较干净.盐等杂质易在异丙醇中沉下.沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷,使DNA易于形成沉淀.

该方法抽提质粒主要的试剂为溶液I,II和III,其在抽提质粒DNA中的作用如下:
   溶液I:由葡萄糖,EDTA,Tris Cl组成.葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏质粒DNA;EDTA的作用是络和掉Mg2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用;Tris Cl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围.
   溶液II:由SDS与NaOH组成.SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性;NaOH(pH>12)的作用是破坏氢键,使DNA分子变性.
   溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液.能中和溶液II的碱性,使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性.K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去.溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质,很容易与小分子的质粒DNA分离,此外,高盐溶液也有利于各种沉淀的形成.
2 煮沸法质粒DNA的抽提
    煮沸裂解法是将细菌悬浮在含有能消化细胞壁的溶菌酶的缓冲液中,然后加热到100℃使其裂解.加热除了能破坏细菌外壁,还有助于解开DNA链的碱基配对,并使蛋白质和染色体DNA变性.但是闭环质粒DNA链彼此不会分离,这是因为它们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构.当温度下降后闭环DNA的碱基又各就各位,形成超螺旋分子.离心除去变性的染色体DNA和蛋白质,就可以从上清中回收质粒DNA.煮沸裂解法对于小于15kb的小质粒抽提非常有效.但对于那些经变性剂,溶菌酶及加热处理后能释放大量碳水化合物的大肠杆菌菌株,则不推荐使用该法.这是因为碳水化合物很难除去,会抑制限制酶和聚合酶的活性.大肠杆菌菌株HB101及其衍生菌株(其中包括TG1)能产生大量的碳水化合物,不适用于煮沸法裂解.该方法的优点是可以快速省时获得一定量的质粒DNA,用于酶切鉴定.

 

碱裂解法抽提质粒DNA所需试剂的配制：

(1)溶液I
葡萄糖 50mM
Tris-HCl 50mM
EDTA 10mM
溶菌酶 5mg/mg 使用前加入
(2)溶液II

NaOH 0.2M
SDS 1.0% 使用前用母液配制
(3)溶液III(pH5.5 3M KAc)

5mol/L乙酸钾 60ml
冰乙酸 11.5ml
(4)苯酚饱和溶液
苯酚溶解后用10mM Tris(pH8.0)平衡至上清中的水相pH升至8.0
(5)氯仿
(6)异丙醇