金溶胶

胶体金的颜色
溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线和种类，是散射光还是透射光，粒子越小，分散度越高，则散射光的波长越短，对同一种物质的 水溶胶来说，粒子大小不同，颜色亦不同，胶体金颗粒在5～20nm之间，吸收波长520nm，呈葡萄酒红色，20～40•nm之间吸收波长530nm，液 体为深红色，60nm的金溶液主要吸收波长600nm，金溶液呈兰紫色，若离心去掉较大的金颗粒，溶胶呈红色。
胶体金的制备
1．制备方法胶体金的制备多采用还原法。氯金酸（HauC14）是主要还原材料，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类 型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。最常用的制备方法为柠檬酸盐还原法。具体操作方法如下：
（1）将HauC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加热至沸。
（2）搅动下准确加入一定量的1％柠檬酸三钠（Na3C6H5O7•2H2O）水溶液。
（3）继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。全过程约2～3min。
（4）冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。
用此法可制备16～147nm粒径的胶体金。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。表19-1列举制备4种不同粒径胶体金时柠檬酸三钠的用量。
表19-1 四种粒径胶体金的制备及特性
胶体金粒径（nm） 1％柠檬酸三钠加入量（ml）*胶体金特性
呈色 λmax
16 2.00 橙色 518nm
24.5 1.50 橙红 522nm
41 1.00 红色 525nm
71.5 0.70 紫色 535nm

注意事项
（1）易潮解，应干燥、避光保存。
（2）氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。
（3）用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。
（4）是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。
（5）胶体金的鉴定和保存：胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。
肉眼观察是最基本也是最简单和方便的检定方法，但需要一定的经验。良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的 胶体金有较多的凝集颗粒。在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。结 制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径。
胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。
影响胶体金颗粒大小的因素
如果有较多的大小不等的金颗粒及有椭圆形，三角形金颗粒存在应重新制备。一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入，而是多次加入。 再者搅拌不均匀，速度太慢没有搅拌起来，造成了颗粒大小不等。制备量的多少，容器的大小，加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备了合格的胶体金以后， 放在室温或4℃保存。避免低温冻存，因为冻存可导致胶体金凝集，破坏了胶体状态。胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右。冰箱内半年左右。根据 胶体金的性质，有不稳定和聚沉的可能性，因此，制备完毕后最好在20天以内进行标记。

胶体金的制备技术
胶体金溶液的制备有许多种方法，其中最常用的是化学还原法，基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。目前常用的还原剂有：白磷、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等，下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液。

一、 制备胶体金的
（一）玻璃器皿的清洁
制备胶体金的成功与失败除试剂因素以外玻璃器皿清洁是非常关键的一步。如果玻璃器皿内不干净或者有灰尘落入就会干扰胶体金颗粒的生成，形成的颗粒大小不 一，颜色微红、无色或混浊不透明。我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净，加入清洁液（重铬酸钾1000g,加 入浓硫酸2500ml，加蒸馏水至10000ml）浸泡24h，自来水洗净清洁液，然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3～4次，自来水冲洗掉洗洁剂，用蒸馏水洗 3～4次，再用双蒸水把每个器皿洗3～4次，烤箱干燥后备用。通过此方法的处理玻璃器皿不需要硅化处理，而直接制备胶体金。也可用已经制备的胶体金溶液， 用同等大不颗粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后弃去，再用双蒸水洗净，即可使用，这样效果更好，因为减少了金颗粒的吸附作用。
（二）试剂的配制要求
（1）所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净，配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水。
（2）氯化金（HauCl4水溶液的配制：将lg的氯化金一次溶解于双蒸水中配成1%的水溶液。放在4”c冰箱内保存长达几个月至1年左右，仍保持稳定。
 
二、制备胶体金的方法和步骤
（二）抗体血酸还原法（Stathis and Fabrikanos 1958）
（1）将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml,0.2mol/L K2CO31.5ml、双蒸水25ml混匀。
（2）在搅拌下加入1ml 0.7%抗坏血酸水溶液，立即呈现紫红色。
（3）加双蒸水至100ml，加热至溶液变为透明红色为止。胶体金颗粒直径为8～13nm。
（三）柠檬酸三钠还原法（Frens 1973）
此方法是由Frens在1973年创立的，制备程序很简单，胶体金的颗粒大小较一致，广为采用。该法一般先将0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾，迅 速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液，开始有些蓝色，然后浅蓝、蓝色，再加热出现红色，煮沸7～10min出现透明的橙红色。各种颗粒的胶体金制备详见表 5-2。

按照Frens法还可以制备出其它不同颗粒大小的胶体金出来。许多研究证明用该法制备胶体金时金颗粒的大小是柠檬酸三钠用量的函数，基本的规律是柠檬酸三钠用量多，胶体金颗粒直径小，柠檬酸三钠用量越少，腔体金颗粒直径越大。
（四）鞣酸?柠檬酸三钠还原法（Slot与Gueeze1985年）
该法是以1982年Muhlpfordt法为基础，1985年Slot与Geuze对该法进行了改良，特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金，而且颗粒的直径均匀一致，很适合于双标及多标研究。
操作步骤：
（1）根据所需要的胶体金颗粒分别配制A液和B液。
（2）将配制好的A、B两液在水浴内加热到60℃，并通过控温装置使温度保持稳定。
（3）在电磁搅拌器上搅拌A液迅速加入B液，继续加热直至胶体金变成葡萄酒色，时间大约7～10min。在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色，大约1～3 min就变成红色。
用鞣酸?柠檬酸三钠还原法，柠檬酸三钠主要为还原剂，而鞣酸则有双重作用，一是还原作用，二是保护作用，控制“晶核”的形成过程，也就是说鞣酸的用量多少决定胶体金颗粒的大小形成，因此改变鞣酸的用量就可以改变胶体金的颗粒大小，达到制备不同直径颗粒的胶体金之目的。
（五）乙醇超声波还原法（Baigent and Muller 1980）
（1）1%HAuCl4水溶浓0.2ml加入100ml双蒸水。
（2）用0.2molK2CO3调pH至中性，再加入1ml乙醇。
（3）用20KC、125w超声波探头浸入溶液内进行超声振荡，由此法制得的胶体金颗粒为6～10nm。
（六）硼氢化钠还原法（Tschopp et al 1982）
（1）将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入0.6ml 1%的HAuCl4。
（2）再加入0.2molK2CO3，0.2ml。
（3）在搅拌下，迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液（0.5mg/ml）0.4ml,一般重复加入3～5次，直至溶液的兰紫色变为橙红色为至。然后再搅拌5min，获得的金颗粒直径在2～5nm之间。
（七）放射性胶体金的制备方法（Kent and Allen 1981）
（1）取0.01% HAuCl4 上水溶液100ml，加热至沸腾。
（2）加入40μl195Au。
（3）迅速加入4ml1% 柠檬酸三钠水溶液，5～7min出现透明的橙红色。
（4）其含量为I×106脉冲数/min。
（八）微波制备液体金方法。