加载中…黄酮含量的测定
(2011-01-24 16:41:43)
标签：
杂谈 |
分类： 植物化学 |
总黄酮含量的测定采用分光光度法，以芦丁为对照，利用黄酮类化合物结构上的酚羟基特征及其还原性进行显色，有邻二位酚羟基或3，5
-羟基取代的黄酮可以与金属离子形成黄色或红色络合物，这些络合物在特定波长有最大吸收。最常用的显色剂NaNO2-Al(NO3)3-NaOH溶液，它们能与黄酮类化合物生成铝络合物，在510
nm处有最大吸收。
按照下列步骤测定植物中总黄酮的含量：精密称取105℃下干燥至恒重的芦丁标准品50 mg，置于250 mL 容量瓶中，加95%的乙醇20 mL使之溶解。再加入蒸馏水定容至刻度，摇匀。取6个25 mL的容量瓶，如表2.2所示，向每个容量瓶中加入黄酮标准液，再加入1.0 mL的NaNO2溶液（5%），摇匀，放置6 min。再加入1.0 mL的硝酸铝溶液（10%），摇匀，放置6 min。最后加入10 mL的NaOH溶液（4%），加入适量去离子水定容至刻度，摇匀，放置15 min。以空白瓶为对照，在510 nm处测定吸光度，绘制标准曲线。分别取提取液1.0 mL，每个样品做两个平行样，按照上述步骤处理，在595 nm处测定吸光度，标准曲线计算出提取液的黄酮含量。
表2.2 黄酮标准液的配制
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管号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
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0.5 mg∙mL-1黄酮标准液（mL） |
0 |
2.0 |
4.0 |
6.0 |
8.0 |
10.0 |
|
5% NaNO2 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
10%硝酸铝 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
|
4%NaOH |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
10.0 |
芦丁 Rutin
异名：芸香甙 ，维生素 P，紫槲皮甙 ， Rutoside , Violaquereitrin
化学名： 4H-1-Benzopyran-4-one,7-[[6-O-(6-deoxy-α-L-mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-,(2S)-(14259-46-2)
分子式：C27H30O16
分子量：610.51
EINECS 205-814-1
食品中总黄酮的测定
（－）目的意义
黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。
（二）高效液相色谱法
1. 原理
2．仪器和试剂
（1）高效液相色谱仪
（2）紫外检测器
（3）层析柱
（4）超声波清洗仪
（5）索氏提取器
（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）
（7）甲醇（色谱纯）
（8）芦丁标准品
（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水
（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液。
3. 操作步骤
（1）样品处理
1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件
色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;
流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；
流
柱
检测波长：360nm；
灵敏度：0.02AUFS；
进样量：20ul。
（3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。
4．结果计算
（三）分光光度法
1．原理
本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。
2．仪器和试剂
（1）722分光光度计
（2）索氏提取器
（3）真空泵，盐基交换管等。
（4）恒温水浴，分液漏斗。
（5）芦丁标准品
（6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。
（7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。
（8）5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。
（9）聚酰胺树脂
（10）去离子水
（11）同前
3．操作步骤
（1）样品处理
1）固体样品：称取1～2g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在80℃水浴下回流3h，至提取液无色为止。粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。在50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。倒出容器内溶液，用30ml热水分3次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。
称取1～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。吸取上述脱脂后的水溶液1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0ml／min，至流出液基本无色，一般收集10ml即可。上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。
2）液体样品：准确吸取1.0ml样品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。
（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相当于芦丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol／L氢氧化钠溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（r）。
（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。
4.结果计算
（四）说明
1．HPLC法与分光光度法比较，HPLC法相对干扰少，重现性好，测定结果更为准确可靠；但其操作较为烦琐，费用较高。分光光度法操作简便、快速、易行，所需费用不高；但易受杂质干扰，稳定性稍差。
2．样品水解后随着放置时间的延长，总黄酮的含量可能会发生变化，因此样品水解后应尽快测定。
3. 随着显色时间的延长，吸光度将略有下降，因此应尽快进行测定。
http://bbs.instrument.com.cn/shtml/20081222/1656464/
2．1 方法
2．1．1 样品溶液的制备
分别精确称取80℃恒温干燥的 样品用50%甲醇回流提取，料液比1：15,提取两次，每次30min，将两次提取液合并浓缩至一定体积，用30%甲醇定容至50ml容量瓶中。从其中取出12ml溶液放入100ml容量瓶中，稀释至刻度，再从100ml容量瓶中取出1.5ml溶液，放至10ml容量瓶中，定容，为待测样品液Ⅰa和Ⅱa。
2．1．2 最大吸收波长的选择
分别作样品液Ⅰa、Ⅱa及芦丁标准品的吸收曲线，均在350 nm 处有一强吸收，因此选择350 nm为测定波长。
2．1．3 标准曲线的制定
精密称取芦丁对照品10.3mg，用少量30%乙醇溶解后，转移至50ml容量瓶，用蒸馏水定容至刻度。分别精密量取2ml、3ml、4ml、5ml、6ml芦丁溶液置于100ml容量瓶中，于350 nm 波长处测定吸光值，以芦丁空白为参比，以芦丁浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，提示在4.12～12.36mg／103ml浓度之间，吸光度值与浓度呈现良好的线性关系。
2．1．4 含量测定结果
分别吸取2．2．1中Ⅰa和Ⅱa待测样品液各适量于石英比色池中，按标准芦丁一吸光度测定法，以样液空白参比，于350nm 波长下测定吸光值，计算各提取液中总黄酮含量。
计算公式为:样品总黄酮含量(%)=0.03692(A+0.1644)/W。
注:上式为通过回归方程转化而来，式中A为测得样品液的吸光度值，W为称样量。
按以上方法测定样品总黄铜的含量之前,先把液在200～700波长范围内进行扫描。结果特征吸收峰与芦丁的相同，便可以按照上法.否则就不行.
http://www.zclw.net/article/sort033/sort037/info-144855.html
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