南京大学生命科学研究院 张辰宇

  

前 言

  

2008年，我和我的团队在国际上首次发现了miRNA在细胞外的超稳定性，提出并证实了血液循环系统中的小RNA是疾病的标志物。

  

之后又提出并证实了“跨界调控的食物miRNA”理论：食物中的外源性植物miRNA在人和动物的消化系统中不被降解，吸收后被运送到了摄食者的血液和组织器官里，跨界调控人和动物体内的靶基因表述，进而影响人和动物的生理和疾病过程。

  

在此发现的基础上，我们进一步提出了“细胞外非编码的小RNA是物种起源与进化的媒介”的假说。我们的这些研究对肿瘤等疾病的早期诊断、个性化治疗，疾病的发病机制、药物的运输方式，食物、中药里新活性成分的认识和鉴定，以及物种间共进化的调节途径和方式等诸多领域产生了重大影响，开创了细胞外RNA研究和应用的新领域。

  

我们幸运地发现了“细胞外非编码小RNA”的现象，利用最新研究成果，包括一些尚未发表的实验结果，解释物种起源与进化的一些现象，回答相关的生物学问题，以期在一定程度上回答“生命从哪里来，又将到哪里去？”这个生命科学的最基本问题。

  

第一章 物种起源、进化和经典遗传学

1、生命的诞生

  

2、生命诞生后，就走上了进化的道路

  

3、生命起源和物种进化对今天的意义

  

生命是信息化的，生命的起始是信息的产生，生命的传递是信息的复制。

  

“RNA世界”假说认为最早的生命世界是由RNA组成的，因为RNA具有遗传信息载体和功能分子的双重性。

  

生命诞生后，就走上了进化的道路。

种群是生物进化的基本单位，物种进化的基本单位是种群而不是个体。

  

自然选择主导着进化的方向。

  

隔离是物种形成的必要条件。

隔离使不同物种之间停止了基因交流，一个种群中所发生的突变不会扩散到另一个种群中。从而使不同的种群朝不同的方向演化。

  

研究结果表明：RNA世界可能并没有完全结束。

2008年，我们首次发现以微小RNA即microRNA（简称miRNA）为代表的非编码小RNA不仅存在于细胞内，还稳定存在于细胞外。

  

2010年，我们发现细胞外miRNA能以外液体的形式从细胞分泌出来，介导细胞间通信交流，是新型信号分子。

  

2012年，我们又率先发现非编码小RNA可以跨物种稳定存在，并在不同物种间跨界调控基因表达。

  

在最新的研究中，我们发现非编码小RNA可以跨代际稳定存在，并在代际间调控基因表达。

  

作为一种全新的调节因子，跨界调控基因表达的细胞外非编码小RNA符合两个基本条件：一是在物种间、代际间稳定存在；二是携带特定的功能信息，并且能够直接作用于其它物种。所以，细胞外非编码小RNA可能介导物种间的共进化与适应，是物种间共进化的与适应的媒介。

  

回到人类的进化不能匹配文明演变带来的选择压力这一问题，也许解决问题的钥匙正在这里。

  

第二章 表观遗传学与miRNA及其他非编码RNA

1、表观遗传学

  

2、非编码RNA

miRNA的发现始于1993年，罗莎琳德·李和维克多·安罗斯等科学家在秀丽隐杆线虫中发现了一种长度越22个核苷酸（22nt）的小RNA，命名为lin-4。lin-4可以导致一种称为lin-14的基因发送沉默，而lin-14的功能是参与秀丽隐杆线虫的发育调控。他们发现lin-4对LIN-14蛋白表达水平的抑制反映在翻译水平，而转录水平未发送变化。

  

遗憾的是，这一发现当时并未引起科学界足够的重视。

  

3、非编码RNA与表观遗传

  

4、非编码RNA与代际遗传

  

5、结语

非编码小RNA，特别是miRNA，既是表观遗传现象的重要组成部分，又是表观遗传的关键调控因子。非编码小RNA是稳定的，承载着细胞独特的遗传信息；它又是活跃的，能感受到外界的微小刺激并迅速作出变化；它还是强大的，一个小分子就能控制成千上万个分子的表达。它与遗传的关系是丰富的。有人已经将精子中的RNA谱命名为“spenn RNA code”。或许 RNA与遗传的大幕才刚刚展开。

  

第三章 细胞外非编码小RNA的发现作用机制与功能

1、细胞外非编码小RNA的发现

在健康人的血清中发现了数量庞大、种类繁多的miRNA，提示miRNA在血液循环系统中存在的普遍性。

各种miRNA的表达水平相当一致，Pearson相关系数（R）接近于1，显示出血清中的miRNA在同一物种中、同一状态下、不同个体间的高度一致性。

  

于是我们得出了这一结论：“无数细胞成分的血清中能够稳定存在miRNA，并且其在不同生理、疾病条件下的表达谱差异具有一定的临床诊断意义。”

  

2、细胞外miRNA的稳定性、来源及分泌机制

  

3、细胞外miRNA的摄取及其在受体细胞中的作用

  

4、细胞外miRNA的应用和生物学功能

植物miRNA能被人体吸收并进入血液循环系统。

  

这些被我们吸收进入人身体各个器官的植物miRNA，还在我们的身体里参与调节生命活动。我们每天吃进去的大量miRNA并没有因为烹饪和人体消化作用而失活，相反，它们还会参与人体内的多种生命活动，以跨越个体乃至物种界限的方式对我们产生深刻的影响。

  

伴随着这一颠覆性的发现在学术界引发了巨大反响。miRNA的跨界调控理论也开始逐渐被学术界所接受。这一理论所造成是颠覆效应，不亚于2008年我们在血清中发现miRNA稳定存在。

  

这一理论使得人们对于miRNA的调控效应有了更加宏大而深刻的认识，无异于在细胞外RNA研究领域引发了又一次革命。

  

2014年，我们又在金银花中发现了一种非典型的miRNA —— MIR2911，这种miRNA在金银花煎煮后的汤汁中也能稳定存在，并能经口服金银花水煎液被动物体吸收。

  

5、结语

  

第四章 细胞外非编码小RNA与物种起源的调节

1、生命可能起源于小RNA

  

2、原始细胞RNA和细胞外RNA隔阂和交流

  

3、miRNA在动物进化中起到抗病毒作用

  

4、结语

  

第五章 细胞外非编码小RNA与动物、植物和微生物间共进化的调节

1、病毒与宿主通过细胞外非编码小RNA相互调控基因表达

生物体不是孤立存在的，而是通过生态系统紧密联系在一起的。近年来，跨物种的细胞间信息交流越来越受到关注。根据目前的研究，它被定义为：不同种类的动物、植物、真菌和细菌通过激素或激素类似物等信号分子彼此之间进行通信。

  

现在普遍认为：miRNA在包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡和代谢等生命活动中。起到了至关重要的调控作用。尤其是最近大量的研究证实了miRNA与癌症、糖尿病等多种疾病息息相关。

  

miRNA不仅能够在初始产生的细胞中具有功能，还可以通过摄食等方式由一个物种传送到另一个物种，并且能够在不同物种间进行跨界调控。

  

这些全新的发现不仅使我们对于植物间信息交流的认识上升到了一个全新的高度，而且很有可能为物种间共进化提供了有力的理论支撑。

  

2、植物与动物通过细胞外非编码小RNA相互调控基因表达

  

3、哺乳动物与寄生虫通过细胞外非编码小RNA相互调控基因表达

  

4、细菌与宿主细胞外非编码小RNA相互调控基因表达

  

5、植物与真菌细胞外非编码小RNA相互调控基因表达

  

6、结语

在未来，研究物种间miRNA的相互作用将是一个全新的令人兴奋的领域，但在我们完全理解外源性miRNA介导的跨物种交流之前，仍然需要很多的研究来探究这些miRNA在不同物种之间转运的机制以及作用机理。

  

第六章  细胞外非编码小RNA与疾病

1、疾病过程中的细胞外非编码小RNA

  

2、细胞外非编码小RNA在疾病治疗中的应用

  

3、结语

  

第七章 细胞外非编码小RNA与生态营养和人类社会

1、生态营养成就了人类社会

生态系统指的是在一个特定空间单位中，生物有机体及其物理环境以及它们之间所有相互关系形成的一个整体。一个生态系统包括非生物组织部分和生物组成部分，前者包括矿物质、气候、土壤、水、阳光和所有其它非生物元素。将这些元素联系在一起的是两个主要的力量：能量在生态系统中的流动以及生态系统中营养物质的循环。

食物链是能量流动和物质循环最显而易见的途径。事实上食物的获得也引发了人类社会的产生。人类学家艾萨克的理论认为：“原始人会把食物带到一个具有社区形式的隐藏处，并在此分配食物。从这个观点来讲，人类文明的原始动机是食物的分配。在共同分配食物的过程中，人类真正履行了最基本的人性。”

  

我们吃的食物甚至可能会改变我们的基因结构。日本人经常在米饭里掺杂海苔。对世界大多数人而言，海苔只是一种调味剂，并不能被人体吸收。日本人则不然，他们的肠道菌群具有特殊的酶，能够消化海苔，最终使海苔中的营养物质被人体吸收。

  

2、细胞外非编码小RNA可能是一种新发现的营养物质

miRNA可能代表了一类新的通用调节剂，对在分子水平上调节植物之间的相互作用起着重要作用。像维生素、矿物质、和其他食物来源的营养一样，植物miRNA可能作为一种新的食物功能成分，对维持和塑造动物身体结构和功能作出重要贡献。

  

3、细胞外非编码小RNA参与调节动物社会中阶层分化的发生

  

4、结语

约1200年的海苔食物史，造就了日本人独有的肠道菌群。人类长期以植物为食，植物中有含量和种类极其丰富的小RNA，这些植物小RNA日复一日、年复一年地通过肠道进入人体。植物miRNA对蜜蜂蜂群阶层的形成很重要。俗话说：“一方水土养一方人。”独特地域的食物对人的身体有影响，是否对心理和行为也有影响呢？甚至是否包括可能对社会结构也产生影响呢？

  

细胞外小RNA可能影响某些关键基因，从而影响人体健康，甚至是整个人类社会是一些方面。在第八章将重点讲述我们如何发现“病毒界青霉素”的故事。我们在中医药中找到一种GC含量高达85%的miRNA，它在多种药用植物、中医药水煎液以及服药动物体内均能发现，能够广谱地抑制多种流感病毒和其他病毒。

  

饮食不仅可以造就人类社会，日常饮食中物质在人类社会文明阶段依然可以施以影响。一些历史学家认为铅中毒可能加速罗马帝国的衰败。金属铅具有极低熔点，以及耐腐性、易提取的化学特性，在罗马帝国中得到广泛使用。由于铅易加工，首先在罗马被用于供水管道系统。事实上现代英文“plumbing”（水暖管道）这个词来自拉丁文“plumbing”（铅）。铅的味道微甜，因而被当做调味品加入罗马的葡萄酒之中，并销往全欧洲。铅在罗马帝国公民的饮食中无处不在，以至于在当时就已经有报道指出，铅会导致严重的腹痛、贫血和痛风。罗马人在欧洲大陆复制了一个又一个具有供水管道系统和葡萄酒的城池，最终整个帝国都陷入铅中毒。

  

在漫长的岁月中，我们一直从生态系统中摄取食物来源的营养物质买这些植物的小RNA对人类社会的形成和发展的影响，暂时还不可考。近年来，我们的营养来源越来越丰富。由于肉食的丰富和食品深加工产业的发展，我们的食物中小RNA已经发生变化。虽然这种变化对人类社会是否有影响暂时不得而知，但是我们不能忽视饮食中的小RNA对人类社会造成的影响。

  

第八章 细胞外非编码小RNA与中医药

  

越来越多的证据表明，表观遗传学能区分“真假”中药。以中国人参为例，表观遗传学分析表明，相比野生人参，栽培人参具有显著低水平的胞嘧啶甲基化（特别是CHG甲基化位点）。这表明驯化已经调控了栽培人参的表观遗传修饰，一些胞嘧啶甲基化变化可能与栽培人参和野生人参的表型差异有关。表观遗传学与“真实”中药之间的关系为中药的质量评价和鉴定提供了依据，其中miRNA的贡献不容小觑。

  

1、金银花MIR2911——病毒界青霉素

我们首先使用深度测试序技术，对金银花中提取的小于30nt小RNA片段进行分析，从中锁定26种高表达的miRNA。接下来我们用双蒸水煎煮金银花30min，制备水煎液，并对水煎液进行深度测序分析，最终找到了MIR2911。最后我们使用荧光定量PCR的方法，为检测得到的MIR2911进行定量，发现每克金银花中的MIR2911含量高达0.34pmol，而每毫克水煎液中的MIR2911含量高达0.06pmol。

  

2、金银花MIR2911与其他疾病治疗

  

3、植物MIR159抑制乳腺癌

  

4、甘草miRNA调控免疫系统

  

5、生姜外泌体miRNA调节肠道菌群，可能缓解肠道炎症

  

6、miRNA与中药质量评价

在传统上，人们基于形态学、颜色或者气味的经验方法鉴别冬虫夏草的真伪即品质。

  

但是因为种种原因，传统的鉴别方法对于鉴别天然加工品及其替代品的惨假基本失去了作用。miRNA可以作为许多天然产物质量控制的生物学标志，检验miRNA也许能作为评价冬虫夏草及其他保健食品质量的新指标。我们利用高通量测序技术，建立了商品化冬虫夏草的小RNA文库。

  

第九章 细胞外非编码小RNA与新型冠状病毒研究

1、发现可预判和监控新冠肺炎患者是否发展为重症患者的血清标志物

  

2、发现金银花可用于治疗新冠肺炎

在前文中介绍过，我们课题组于2015年在Cell Research杂志报道了再中药金银花中鉴定出了一种能够直接抑制病毒复制的有效成分MIR2911，这种miRNA能够稳定富集于金银花水煎液中并在动物体内直接抑制流感病毒。此后，我们发现MIR2911在94%的病毒基因组上均具有结合位点，金银花水煎液能够抑制埃博拉病毒、寨卡病毒。非洲猪瘟病毒的复制，是一种广谱的抗病毒药剂。

  

因此，在预测新冠病毒基因组中能否产生miRNA的同时，我们也预测了金银花中抗毒活性成分MIR2911在新冠病毒的基因组中的结合位点，率先发现了179个可能的MIR2911直接结合位点，分布于新冠病毒的整个基因组上，且在病毒编码的全部蛋白质上都有MIR2911的结合位点。随后我们在实验中验证了其中的29个结合位点确实能够与金银花里的MIR2911直接结合。

  

研究发现正常人在喝了金银花水煎液以后，MIR2911能够被胃上皮细胞吸收，进是而被组装进胃上皮顶细胞的外泌体内，最后分泌到血液循环系统，所以我们实验室的老师和学生喝了金银花水煎液，然后抽血，将血液中的外泌体提取出来，再检测到这些外泌体能不能抑制新冠病毒S蛋白的表达。结果发现喝了金银花水煎液以后，人的血液中MIR2911浓度显著升高并在外泌体重大量富集，且能够显著地抑制病毒S蛋白的表达。在MIR2911浓度大约为10pmol/L的情况下，能够抑制90%活的新冠病毒的复制。

我们进一步挖掘试验结果，有了更深层次的发现。在哺乳动物如小白鼠和人的胃黏膜的顶细胞中有一个sidtl基因，这个基因编码的蛋白质能够转运食物中的miRNA带到血液循环系统，再将它们带到各种组织中。在前期大量的实验中，我们发现华东地区的人群中有10%~15%的可能性在sidtl基因上有一个突变位点，携带突变位点的人不能吸收或极大地降低了对食物中miRNA的吸收能力。从这个结论出发，我们发现sidtl基因突变的人喝了金银花水煎液以后由于不能吸收MIR2911，所以，不能抑制病毒。

  

值得一提的是，剑桥大学和巴塞罗那大学等国际知名研究机构也与我们课题组展开合作，开始使用金银花进行新冠肺炎患者的临床治疗。而中药连花清瘟胶囊虽然在临床中发现有效，但是比较难得到国外生物医疗领域同行的认可。究其原因，主要是我们利用了现代分子生物医学、遗传学等手段阐明了传统中医药金银花直接抑制病毒复制的作用成分和作用机制，这样的方式比较容易得到国外生物医疗领域同行的接受和认可，为未来中药的国际化推广提供了一条值得借鉴的途径。

  

3、发现高龄且/或有基础性疾病（诶糖尿病等）的人感染新冠病毒后易发展成重症的关键分子机制

  

5、结语

我们课题组针对新冠病毒肺炎疫情的系列科学发现（图9-1），淋漓尽致地展现了从原创理论到实际应用的整个过程。这些发现一方面力证了我们前面几章中所提到的细胞外miRNA和疾病、中医药的关系，以及植物miRNA、动物miRNA和微生物之间的互相作用。更为重要的是，该系列发现不仅对新冠肺炎疫情的诊断、控制和治疗有潜在的帮助，并且在对未来可能发送的病毒变异后再次爆发疫情进行诊断、治疗、防控以及应对潜在的以病毒为载体的生物战等方面都有较大的意义。

  

第十章 展 望

  

地球上存在生命的历史大约有35亿年，但是人们真正研究生命的形态及组成的历史只有短短几百年，对于生命存在的形态以及组成生命的各种成分的理化特性和功能，人们远未了解清楚。

  

在传统观念里，RNA作为一种核酸是非常不稳定的，我们关于细胞外 miRNA的超稳定性的发现证明了RNA的理化性质并不是均一的，RNA可能具备我们现在并不清楚的理化特性。细胞外 mirNA的特殊理化性质赋予了其调节物种共进化与适应的功能，其部分意义或许如一篇文章（《吃啥补啥，心诚则灵与针灸的最新生物学解释》）里面描述的：通过 miRNA，甚至可能还有别的化学物质，物种之间其实还在传递更加精细和丰富的生物学信息，甚至可以说，物种之间在直接对话。例如，羊吃草的时候，草里的 mirNA可能会直接干预羊的生活；人吃羊的时候，羊肉里的 mirNA可能会干预人体的活动；人死之后，人体内的 MirNa可能还会影响泥土里微生物和植物的状态。如果这一切得到证实，地球生态系统还真的可以看作一个有机的整体，而人和环境的关系也远远不是索取和利用那么简单。也许从某种意义上说，人类的世界观都会因此重塑。

  

在我们已经搭建了整体框架的细胞外非编码小RNA介导物种间共进化与适应的领域里，现在已经有了很清晰的如何继续深入研究细胞外RNA“意义非凡的功能”的思路。

  

第一，继续探究细胞外RNA的理化特性，研究其为什么能够稳定，在什么情况下能够稳定。

通过对理化特性的研究发现其介导的生物学功能，甚至在研究理化特性时深入探索生命存在的基本形式这一根本问题，例如，RNA本身是不是生命？细胞外RNA本身是否是生命？细胞外RNA的共进化调节作用是否是RNA世界遗留下来的作用，或者是RNA世界遗留下来的生命形式？我们通过对细胞外RNA理化特性的研究将会对生命本质有更深入的理解，更好地回答“生命从哪里来，又到哪里去？”这个问题。这或许就是研究RNA或者细胞外RNA理化特性的根本意义。

  

第二，研究细胞外miRNA在已有生命体系中的产生机制和功能。

在原核单细胞生物中，CRISPR系统（一种适应性免疫系统）用来抵御外源生物（如病毒）的侵入。而在真核单细胞生物中，这一功能或由miRNA/siRNA完成。当进化为多细胞复杂系统的生命形式时，生物体出现了整体的以抗原、抗体以及细胞因子等依赖于蛋白质为基础的免疫系统。而这时，miRNA的功能就共进化为调节细胞自身内源性基因的表达，同时还能以被细胞分泌出来的分泌形式发挥功能。这些共进化的假说和机制的研究现在几乎是空白，需要更多研究者关注和深入研究。

  

此外，随着具有特定生物学功能（不仅仅是遗传信息的信使作用，以及tRNA、rRNA等无特定生物学作用）的功能性RNA在细胞内出现，细胞也应该进化出特定的亚细胞器，miRNA等功能性RNA的生成、分泌、修饰等都需要一类特定的亚细胞器来参与和调控。是否存在与细胞内miRNA或者其他非编码RNA相关的亚细胞器？如果存在，那么其组织和调节机制等将是下一个必须研究的关键科学问题，然而现在对于这部分的认知仍然处于空白。

  

第三，研究细胞外miRNA在调节物种共进化与适应中的功能。

蜂粮中的植物miRNA或者其它非编码RNA可以影响蜂蜜的层级分化；金银花等中药里的miRNA具有广谱的抗病毒等作用；动物、植物与人类之间通过miRNA的相互作用对植物生长产生具体影响，以及通过食物链可能影响动物在特定地区的生存与繁衍。在这个过程中，人类由于接受特定地区的食物，是否也会反过来影响人类自身的生理、心理和行为，甚至影响整个社会意识形态的形成等？细胞外miRNA参与调控物种共进化与适应，将是一个几十年都做不完的研究，全世界的研究者都可以继续探索下去。

  

第四，研究细胞外miRNA的原理和技术在医药、农业、生物学以及营养食品等方面的应用。

我们已经发现了动物和人类的体液中，包括血浆、血清、尿液、腹水、脑脊液、乳液等中稳定存在miRNA，这些miRNA既可以作为疾病诊断的生物标志物，也可以作为新一类的治疗靶点；我们发明了第三代siRNA/miRNA药物体内递送系统，可以真正实现个体化精准治疗，使在RNA水平的精准治疗成为可能；通过植物中药水煎液中具有疾病治疗作用的miRNA的鉴定，为中医药的现代化推广提供了新的途径。

  

我们最早发现食物中存在具有生理调节或疾病治疗作用的miRNA，也说明了植物中的miRNA可能是食物中的一类新营养物质，它们如何影响人类或者动物的生理过程都需要进一步研究。

  

这些基于细胞外RNA在医药、农业和生物技术等领域的研究将会开启一个崭新的RNA生物新时代。

总而言之，细胞外miRNA特有的超稳定性，以及细胞外RNA的结构和理化特性使得其能介导物种共进化与适应。这事一个全新的领域，大部分都是未知的，值得长期深入研究。或许这样的研究正在帮助我们开启一个生物学新的时代。