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蛋白质银染方法介绍以及经验分享

(2007-07-17 19:43:25)
标签:

生物化学

银染

经验

    银染是和考马斯亮蓝染色相比,在分辨率上要强很多,在分析细胞组织蛋白组分差异性的时候经常会用的。关于银染有很多不同的方法,这里就比较严谨和繁琐的一种方法介绍一下:实验步骤如下:

1、固定  室温10min,200ml(以充分浸透为准);

配方:乙醇:冰乙酸:水=4:1:5;

2、dH2O漂洗充分,200ml,10min;

3、加敏化剂,室温5min,200ml(以充分浸透为准)

配方:戊二醛(成品:25%水溶液) 200ul,

      甲醛:(成品:37%)10ul。

乙醇: 40ml,稀释成100ml

4、40%乙醇(V/V)充分漂洗,200ml,20min,

5、dH2O充分漂洗200ml,20min,

6、加敏化剂,100ml,1min;

配方:0.02%硫代硫酸钠(w/v)即0.2g/L;

7、dH2O充分漂洗,200ml,2次,1-2min/次;

8、加0.5%硝酸银(w/v) ,200ml室温20min;

以先配成20%母液(2g/10ml)新鲜配制使用;

9、dH2O充分漂洗,200ml,2次,1-2min/次;

10、加显色剂100ml至胶转黄(约1min);

重新换新的显色即直到所需显色情况(约15min)

配方:碳酸钠 5g,甲醛(37%) 0.02%(v/v)加水200ml即成。

11、终止:5%冰乙酸,5min;

12、保存,于0.03%碳酸钠中

     需要说明的是,显色剂中的0.02%(v/v)是成品甲醛的浓度,而不是甲醛的真实浓度,也就是在200ml中加入0.04ml,我在做的时候以为0.02%(v/v)是甲醛的终浓度,导致我加入甲醛是0.108ml。

    另外我做了几次,第二次我做失败过,在显色的时候胶带什么都没有,一块白,仔细回忆,我想可能在硝酸银染色后用水洗的时间太长,把硝酸银都冲洗掉了,导致最后无法显色,在baidu和丁香园的搜索后我更加坚定了这个想法。由于蛋白样品比较珍贵,因此面对这样一块白色的胶带我郁闷了很久,最后我仔细看了一下步骤,觉得重新染色的可能性很大。于是我用水反复冲洗,把显色液冲掉,然后再用硝酸银染色,最后重复了一下,这次我很注意用水洗得时间。最后结果显示我的想法是对的,如果没有染色上可以重新染的。而且奇怪的是这次操作的染色比之前做过的还要好,条带很清晰,尤其是那些微量蛋白带都很明显。

 

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