１.　线性ＤＮＡ可以提高稳转细胞株的形成效率。

　　环状质粒整合如基因组的位置是不固定的，但是线性质粒的整合位点是确定的（本人对这一点表示怀疑）。

２.　使用二次转染法可以提高转染效率。

　　具体方法是在第一次转染细胞过后３小时后换生长培养基，再过２４小时，再进行一次转染，转染后３小时换２％血清的维持培养基维持培养２４小时。（此法可以在第一天中午接种１０％左右的细胞，然后第二天早上第一转染，中午换液，第三天中午再次转染，３小时候换２％低血清浓度培养液，培养２４小时后进行进行筛选）。

　　本方法参考任丽伟等人发表在２０１０年　第３７卷　第五期《中国畜牧兽医》上的　“提高基因转染效率方法的研究”　但是本人没有进行过验证是否真是有效，等待验证过后会给出答案。

３.　转染时的细胞状态非常重要，旺盛生长期的细胞转染效率最高。

　　一般在细胞生长密度达到７０％左右的时候转染最为适宜，但是不同的细胞株可能有特殊的情况，因此转染时需要注意自己的细胞株有没有特殊的要求。

４.　在转染前对细胞进行饥饿处理，有助于提高转染效率。

　　一般情况下在转染前半小时换上无血清培养基，饥饿上半小时，然后在加入转染试剂，进行转染可以提高效率。

５.　有人使用纤连蛋白＋脂质体的方法可以提高转染效率２－３倍。（纤连蛋白真有这么大的作用，还是针对某些特殊的细胞系有特殊的作用？）

       总结玩上面这些之后，我突然有了一个想法，就是利用目前比较火的CRISPR-CAS9系统，进行稳转克隆株的构建。初步想法如下，在基因组上选择合适的位点，将这个位点的旁邻序列链接到需要稳转的基因两边（这个被转染表达的基因包括启动子和PloyA序列），然后利用CAS9在选定位点切开，利用同源重组，将目的基因整合入基因组中。

       以CRISPR-CAS9的切割诱导重组的效率，肯定比直接转线性DNA进行非同源重组的效率要高许多吧。

       我将会测试这个想法，如果成功的话，我会在这里公布实验结果。