环境安全型畜禽舍微生物的检测方法

 

随着环境安全型畜禽舍理念的推广，其实施地域愈来愈广泛，核心设备3DDF系列畜禽舍空气电净化自动防疫系统和粪道等离子体除臭灭菌系统的使用量愈来愈大，一些用户还研究了这种新型的畜禽舍中空气微生物浓度的变化和臭气，众多的实践肯定了核心设备的优良性能，并成为积极地推广者。然而，也有一些客人的测定结果与他人很不同，其原因就在于检测方法的不同，下面就测定的标准做一表述，以期望大家做出基本一致的结果，并唤起其他养殖企业的青睐。

一、环境安全型畜禽舍微生物的检测方法

1.环境要求

（1）全封闭；

（2）无空气扰动（不通风）；

（3）相对湿度：40～90%；

（4）温度：0～32℃

2.一般要求

2.1 畜禽舍的选择

按照检测需要的环境要求选取全封闭的对照舍和试验舍；如果没有合适的对照舍则需要关停试验舍的空间电场和除臭设备，停运3天后的畜禽舍方可作为原始菌浓度的对照舍，取样测定完毕后再行启动前述设备并在3日后同一时间进行检测。

 2.2取样点的确定

每舍按照“四等分对角线选点法”选定取样点，每舍取样点设置5点。见图1.http://s6/bmiddle/6d37214bhbb8fabcc3525&690

取样高度：网床或笼养鸡舍为距地面0.8～1.5m的高度处。猪和网上肉鸡舍取小值，笼养蛋鸡取大值；对于地面养殖舍，取样高度为0.45～1.0m。鸡鸭等小型动物取小值，牛羊等大型动物取大值。

2.3 取样同时性的保证

试验与对照舍同时取样。如无对照舍可参照前述第2.1节的描述进行取样。

2.3.1 定时器控制的空间电场间歇循环出现的环境

空间电场系统工作3天后方可取样检测。

取样时间应在空间电场系统停止工作后的10分钟内结束。

2.3.2 空间电场恒定出现的环境

空间电场系统持续工作3天后方可取样检测。

2.4 其他

 作为环境安全型畜禽舍，由于动物的活动，每时每刻的空气微生物浓度都在变化，最完善的测定应该是日监测，即喂料时刻、吃料高峰期过后、休息三个时间段的空气微生物浓度变化。

2.5 监测方法

建议优先采用撞击法，其次采用自然气液混合法，第三为简易定量测定法。

3. 菌浓度的检验

3.1 撞击法

 以缝隙采样器为例，用吸风机或真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝而被抽吸到营养琼脂培养及平板上。狭缝长度为平皿的半径，平板与缝的间隙有2㎜，平板以一定的转速旋转。通常平板转动一周，取出置于37℃恒温箱中培养的48h，根据空气中微生物的密度可调节平板状动的速度。采集含菌高的空气样品时，平板转动的速度要比含菌最低的空气样品的转速快。根据取样时间和空气流量算出单位空气中的含菌量。采样器的规格各国不一，可按说明书操作。下面给出一种实用的监测方法：

          3.1.1仪器和方法

          3.1.1.1仪器撞击法采样用JWL－ⅡB型多功能空气微生物监测仪，用盛有4.5ml营养琼脂 培养基的直径为5.5cm平皿采集空气样品。

          3.1.1.2 原理JWL－ⅡB型多功能空气微生物监测仪通过抽气动力作用，使悬浮在空气中带菌离子与空气同时通过窄缝产生高速气流与介质表面相遇，微生物粒子在惯性作用下撞击到介 质上被采集，从而测定环境中带菌粒子的浓度。

         3.1.1.3方法

         （1）撞击法

    根据不同的采样时间采集样品，采样后平皿经37℃、48小时培养，计数，按下式计算空气细菌数，以cfu /m³报告结果：

    空气细菌总数(cfu/m³)=N×1000/(Q×T)

    式中：N—平皿菌落数、Q—流量(L/min)、T—采样时间(min)。

         （2）现场监测点的选择

           面积100㎡以上的场所设5个采样点(梅花布点)，100㎡以下者设3个采样点(对角线布点)，在不同的采样点上同时进行沉降法和撞击法采样测定。

         （3）数据处理

    采用SPSSV8.02统计分析软件包进行相关回归 分析、方差分析、配对t检验。

          2结果与讨论

    撞击法的灵敏度高，可以准确地测出空间电场环境中空气微生物的实际含量，能客观地反映出不同清洁程度场所的舍内空气微生物含量的差异。 

 

3.2 泵液过滤法

该法是抽取定量空气通过一种液体吸收剂，然后取此液体定量培养计数出菌落数。

（1）将无菌的液体培养基或无菌水与真空泵相连，以每分钟10L速度取空气样并剧烈震荡，使阻流在液体中的气溶胶或微生物均匀分散。

（2）吸取上述含菌液体吸收液1mL与融化冰冷却到45℃左右的营养液琼脂做倾注培养，同时做三个平行试验，置37℃恒温箱中培养48h，计算平均菌落数。根据下列公式计算

 

http://img.blog.163.com/photo/DZtip75FUA74wrzdbp9syQ==/856809829108678940.jpg

式中X—每1m³空气中的细菌数；

式中Vs—吸收液体量，mL；

式中Va—空气过滤量，L；

式中N—每1mL液体培养基中的细菌数。

3.3 自然气液混合法

该法是将一定体积的含菌空气通入无菌蒸馏水或液体培养基中，依靠气流的洗涤和冲击使微生物均匀分布在介质中。然后取一定量的菌液涂布于营养琼脂培养基平板，或取一定量的菌液于无菌培养皿中，倒入10mL融化的营养琼脂培养基，混匀，冷凝制成平板，置于培养箱中培养48小时，取出计菌落数。

3.3.1材料仪器

（1）采样器：盛有200mL无菌水的高脚三角瓶（500mL)5个；盛有10L的蒸馏水瓶（15L）5个。

（2）无菌平皿、无菌吸管等。

（3）营养琼脂培养基、查式培养基、淀粉琼脂培养基（高氏一号）。

3.3.2实验步骤

（1）按实验图2，安装空气采样器。

（2）按实验图1将五套空气采样器分放在五个点上。

（3）打开蒸馏瓶的水阀，使水缓慢流出，这时外界的空气被吸入盛有200mL无菌水的高脚三角瓶中，至10L水流完后，则10L水中的微生物被截留在200mL的无菌水中。

（4）将5个三角瓶的过滤液充分摇匀，分别从中各吸1mL过滤液于无菌培养皿中（平行做3个平皿），然后加入已融化而冷却到45℃的营养琼脂培养基，摇匀，凝固后置37℃培养。

（5）培养24小时后，按平板上长的菌落数计算出没升空气中细菌的数目。先按下式分别求出每套采样器的细菌数，再求出五套采样器细菌数的平均值。

（5）菌数/L=1mL水中培养所得菌数×200/10

http://s15/bmiddle/6d37214bhbb8fc7ef9f4e&690
图2 自然气液混合采样器

3.4 简易定量测定法

用无菌注射器定量抽取空气，将所取空气压入培养基内部，经培养后，即可定量、定性测定空气中微生物，此法简单易行。

（1）将无菌固体培养基融化后，在50℃水浴中保温备用。

（2）利用50～100mL无菌注射器抽取待测环境空气20～100mL。

（3）在无菌操作下，取已融化培养基倒入无菌平皿中，平皿稍作倾斜，将注射器插入培养基深处，缓慢将空气压入培养基内，轻轻摇匀以消除气泡。待培养基凝固，置于30℃恒温箱中培养3d后统计菌落数量，推算1L空气所含菌量。通过菌落形态定性微生物，如统计霉菌数量时培养的时间稍许延长。应用此法需多做平行试验，求其平均值以提高准确性。

  4.评价

 某些取样可造成菌群的无法计数，此时应根据经验给出估测或根据灰暗程度给出判断。

 5.结果分析

 通常由控制器控制的空间电场环境中空气微生物浓度日变化要比对照低30-70%,这样的低浓度有助于动物自然抗体的产生，也就是出栏的仔猪和雏鸡放在农家好养。而在恒定工作的空间电场环境中，空气微生物浓度的日变化约为对照的40-90%,防疫效果好，但设备投入成本高。

 

二、为什么不能使用落菌法监测空间电场环境中的空气微生物浓度？

 

由于空间电场具有静电除尘的作用，它会将空气中的粉尘（微生物气溶胶）定向驱除到任何接地的物体上，如果我们采用沉降法监测畜禽舍中微生物气溶胶含量势必会造成极大地误差。因此，在空间电场环境中不采用沉降法监测微生物气溶胶。

附：沉降法   

将盛有培养基的平皿放在空气中暴露一定时间，经培养后计算出其上所生长的菌落数。此法简单，使用普遍，由于只有一定大小的颗粒在一定时间内才能降到培养基上，因此，所测得微生物数量欠准确，检验结果比实际存在数量少，并且也无法测定空气质量，所以，仅能粗略计算空气污染及了解被测趣味生物的种类。

【检验方法】

（1）将一直被好的营养琼脂、查氏培养基及高氏1号三种平板置于待测地点，打开皿盖在空气中暴露5~10min。

（2）盖上培养皿盖，置于℃培养24~45h，根据平板上所生长的菌落数计算出1m³或1L空气中的细菌总数。

（3）计算，奥梅梁斯基认为：在面积为100cm2平板琼脂培养基表面上，5min降落的细菌数经37℃培养24h后生长的菌落数和10L空气中所含的细菌数相当。根据奥氏公式计算

 

空气细菌总数(cfu/m³)=N×5000/(A×T)

 

式中：N—平皿菌落数、　A—平皿面积(cm²)、T—平皿暴露时间(分钟)

经测定发现，用奥氏公式计算的浮游细菌数比实测的浮游细菌少。原因是此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流情况、人员密度和活动情况。