加载中…SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）
(2016-01-29 09:20:55)
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sds蛋白质 |
分类： 科技 |
在1967年由Shapir0建立，1969年由weber和Osborn进一步完善。
聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子
由于SDS PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以忽略不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量
SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指
特性
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
1．样品的浓缩效应
以往不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tri s—HCl，
pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，
2．分子筛效应
蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过9．0)，使Gly解离成负离子的效应增加；同时因
1．SDS与蛋白质的结合按质量成比例(即：1.4g SDS /g蛋白质)，蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。
2．用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质
3．有些蛋白质由亚基(如
4．有的蛋白质(如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质)不能采用该法测相对分子量。
5．如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。
蛋白质的分子量测定-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
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目的要求
实验原理 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 试剂和器材 一、试剂 30％分离胶贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 10％浓缩胶贮存液：10g Acr,0.5g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 分离胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。 浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。 电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）:称取Tris 6.0g, 甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L。 样品溶解液：取SDS 100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1mL，溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷酸缓冲液0.5mL，加重蒸水至10mL（遇液体样品浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体 染色液：0.25g考马斯亮蓝R-250，加入454mL 50%甲醇溶液和46mL冰乙酸即可。 脱色液：75mL冰乙酸，875mL水与50mL甲醇混匀。 10%过硫酸铵溶液；10％SDS溶液；1％TEMED。 二、材料 标准蛋白：溶菌酶（Mr 14 300）、胰凝乳蛋白酶原(Mr 25 000)、胃蛋白酶（Mr 35 000）、卵清蛋白（Mr 43 000）、血清白蛋白（Mr 67 000）等。按每种蛋白0.5-1mg/mL配制。可配成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。 二、器材 DYCZ-24D型垂直板电泳槽；移液管1 mL（′ 3），5 mL（′ 4），0.5mL（′ 1），0.1mL（′ 2）；烧杯100mL（′ 2）；细长头的吸管；微量注射器。 操作方法 一、 安装垂直板电泳槽 1. 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠； 2．用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板； 3．用蒸馏水试验封口处是否漏水。 二、 制备凝胶板 1．分离胶制备：取分离胶贮存液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液(PH8.9)2.5mL,10％SDS 0.20mL, 去离子水10.20mL, 1％TEMED2.00mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。 用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3－4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。 浓缩胶制备：取浓缩胶贮存液3.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，1％ TEMED2.00mL, 4.60mL去离子水，10% 过硫酸胺0.05mL，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。
三 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.5mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。处理好的样品液如经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1分钟，以消除亚稳态聚合。 四、加样 一般加样体积为10－15μL（即2－10μg蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 五、电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至20－30 mA。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 六、染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白区带清晰，即可计算相对迁移率, 见图4.1。
http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/08/19/A1376636682.jpg 图4.1标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图 七、结果处理 测量由点样孔至溴酚蓝及蛋白质带的距离（mm），计算相对迁移率（Rf） Rf =样品移动距离（mm）/溴酚蓝移动距离（mm） 以标准蛋白分子量的对数作纵坐标，相对迁移率作横坐标制作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出其分子量。 注意事项 （1）用SDS-凝胶电泳法测定分子量时，每次测量样品必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。 （2）因SDS可吸附考马斯亮蓝染料，染色前先用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS。可使染色及脱色时间缩短，并使蛋白带染色而背景不染色。
思考题 1．用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时为什么要用巯基乙醇？ 2．是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量？为什么？ |
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