植物水稻DNA的提取及扩增技术

一．实验原理　

    DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。PCR技术的基本原理类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。  

二．实验试剂及仪器

1.实验试剂

   液氮

  ‚ 抽提液

  ƒ 氯仿

  ④ 无水乙醇,70%乙醇

  ⑤ TE溶液

2.仪器

  离心管、玻璃研钵、研棒、水浴锅、离心机、PCR管

三．实验步骤

                    植物水稻DNA的提取

（1）取水稻幼叶5cm左右放于2 ml离心管中,加入少量液氮，用玻璃研棒研碎；

（2）加入400μl抽提液，置于56℃水浴中20min；

（3）加入等量，振荡30min，充分混匀；

（4）14000rpm离心5min。取上清液于1.5ml离心管；

（5）加入2倍体积预冷的无水乙醇，轻轻混匀，静置直到DNA析出；

（6）14000rpm离心2min，去上清液。加入70%乙醇漂洗；

（7）适当风干，溶于100-200μl TE溶液中待用。

PCR扩增技术

⑴　PCR反应混合液的配制（n为反应数）：

　     n×2.0μl 反应缓冲液（即10×PCR Reaction Buffer，其中含15mM MgCl₂）

        n×2.0μl  dNTP(2mM,each)

        n×1.5μl  引物F(2μM)

n×1.5μl  引物R(2μM)　

n×0.1μl  Taq酶(5U/μl)　

混匀,取19μl分别加入n个0.2ml PCR管中，各管加入模板DNA 1μl，轻轻用手摔一下。

⑵ PCR反应程序设计如下:

    PCR反应在带热盖的PCR仪上进行，大约需要两个半小时.