菌种活化的操作步骤与注意事项及常见问题与解决方法！

 

 

一、菌种活化步骤

 

1、准备工作

 

培养基选择：根据菌种特性选择适宜培养基（如LB培养基用于大肠杆菌，PDA用于真菌）。特殊菌种需添加特定成分（如乳酸菌培养基中的碳酸钙）。

 

器材灭菌：使用高压灭菌锅处理培养基及工具，液体培养基分装后灭菌避免污染。

 

预处理保存菌种：

 

冻干粉：无菌环境下用液体培养基复水，静置30分钟后再接种。

 

冷冻菌种：快速解冻（如37水浴）以减少冰晶损伤，或于冰上缓慢解冻。

 

2、接种操作

 

无菌操作：在超净台或酒精灯火焰附近操作，使用接种环/针蘸取菌种，接种至固体（划线法）或液体培养基（振荡培养增加溶氧）。

 

接种量控制：避免过量导致代谢产物抑制，或过少延长活化时间。

 

3、培养条件优化

 

温度：根据菌种需求设定（如大肠杆菌37，霉菌28）。

 

气体环境：好氧菌需摇床培养，厌氧菌用厌氧袋/罐，兼性菌静置培养。

 

时间：通常12-48小时，定期观察菌落或浊度变化。

 

4、活化验证

 

生长状态观察：固体培养基观察菌落形态、颜色；液体培养基检测浊度或沉淀。

 

镜检与检测：革兰染色确认纯度，PCR或生化试验（如氧化酶试验）验证特性。

 

二、注意事项

 

1、严格无菌操作

 

使用生物安全柜处理病原菌，工具灼烧冷却后接触菌种，避免交叉污染。

 

2、培养基适配性

 

挑剔菌种（如支原体）需添加血清或特殊营养物质，注意pH调整（如酵母菌偏好酸性）。

 

3、传代次数控制

 

连续传代超过5次可能导致基因突变，建议每代保存备份（如甘油管冻存）。

 

4、详细记录参数

 

记录培养基批次、培养时间、温度及异常现象，便于追溯问题。

 

5、活化后保存

 

短期保存用斜面（4），长期用甘油冻存（-80）或冻干，避免反复冻融。

 

6、生物安全

 

病原菌需在相应生物安全级别实验室操作，废弃物高压灭菌处理。

 

三、常见问题与解决

 

1、菌种不生长

 

原因：培养基不适、保存失活、培养条件错误。

 

解决：更换培养基批次，延长培养时间，验证保存菌种活性。

 

2、污染处理

 

发现杂菌立即废弃，彻底灭菌环境，重新活化并排查污染源（如操作或灭菌漏洞）。

 

3、活性不足

 

优化培养条件（如调整pH、溶氧），使用新鲜培养基或添加生长因子。

 

4、变异风险

 

定期进行菌种鉴定，减少传代次数，使用抗突变培养基。

 

四、高级技巧

 

梯度活化：对难复苏菌种（如放线菌），先接种至贫营养培养基再转接富营养培养基。

 

共培养：某些依赖共生菌的菌种需与伙伴菌共同培养。

 

活力检测：使用荧光染料检测代谢活性，或ATP生物发光法量化活菌数。

 

通过系统化的活化流程和严格的操作规范，可最大限度恢复菌种活力，为后续研究或生产提供可靠菌源。

 

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